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针对性问题： |
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吴教授回答： |
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问题1：在新闻（http://www.eurekalert.org/pub_releases/2012-02/mgh-mgr022112.php）原文提及“the protocol used to isolate OSCs in the 2009 Nature Cell Biology study is a relatively crude approach that often results in the contamination of desired cells by other cell types（2009年中国研究人员在Nature Cell Biology杂志的研究中采用了相对简略的方法来分离OSCs，这有可能会导致其他类型细胞的污染）”。
卵母细胞与雌性生殖干细胞 |
众所周知，成年雌性哺乳动物排出的卵子与精子结合孕育出新生命，卵子就是由卵巢中的卵母细胞发育而来。目前，科学界普遍认为：女性和绝大多数雌性哺乳动物的卵母细胞的产生仅发生在胎儿期，出生后卵母细胞的数目不再增加，反而逐年减少，这意味着出生后卵巢无生殖干细胞存在。
吴际教授研究组向传统观念发起了挑战：她们首次在雌性老鼠体内发现了雌性生殖干细胞，并将其移植进入不育老鼠的体内，使其能繁殖后代。这一研究可能会改写教科书，也为治疗雌性不育提供了希望。
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答：以免疫亲和技术为基础的分选细胞方法通常能获得高纯度的细胞, 它包括免疫磁珠分选法(MACS)和荧光激活细胞筛选法（FACS）. 这两种方法只是操作的步骤不同，但原理都是细胞和某种特异性蛋白结合，在磁场或者流式细胞仪的分选作用下将该种细胞分离，所以只要使用同一种特异性蛋白分选，无论是使用MACS还是FACS法，得到的细胞都是同一种类型的细胞。MVH是生殖细胞特异性表达蛋白，且主要在细胞胞质中表达. 我们课题组(2009年发表的成果)首先通过生物信息学的方法预测出MVH蛋白含有跨膜结构域，并将其用于小鼠雌性生殖干细胞的分离，实验结果证实了我们的预测，获得了雌性生殖干细胞。这一结果于2009年发表在Nature Cell Biology (2009; 11: 631-636)上。从而首次阐明具有跨膜结构的胞质蛋白，只要能获得含有跨膜结构域的特异性抗体均能用作细胞分选的特异性蛋白。因此，大大扩大了上述两种方法的使用范围。因传统用于上述两种方法中的特异性蛋白通常为膜蛋白，但该类蛋白数量有限，故使上述两种方法使用受到限制。Tilly课题组于2012年发表在Nature Medicine的文章，也是用MVH作为特异性蛋白进行分选，只是用了FACS而已，并成功的分离到了雌性生殖干细胞，这一结果与我们的研究结果一致，并验证了我们研究结果的正确性。因为我们和Tilly课题组都是用MVH作为分选标志物，所以不论是用磁珠还是流式，分离到的细胞都是一样的，无细胞污染之别。此外，我们除了使用MVH外，还辨认了另外一种用于雌性生殖干细胞分选的特异性蛋白Fragilis。
流式细胞仪分选方法适合细胞较多的情况下分选, 而磁珠分选方法适合细胞数目较少的样本分选. Tilly课题组是收集了六个做变性手术人的全部卵巢, 有大量的细胞样本，所以采用流式细胞仪分选法。文章中说用磁珠洗不干净的问题,我们在Improved efficiency of female germline stem cell purification using fragilis-based magnetic bead sorting. Stem Cell and Development 2011这篇文章中已经讨论得很清楚了, 通过磁珠分选法不存在这类污染的问题。 |
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问题2.Tilly认为“The 2009 study from China also had isolated OSCs based on cell-surface expression of a marker protein called Ddx4 or Mvh, which previously had been found only in the cytoplasm of oocytes……it was expressed on the surface of a rare and distinct population of ovarian cells identified by numerous genetic markers and functional tests as OSCs”（2009年来自中国的研究分离出的OSCs是基于一种在细胞表面表达的标记蛋白Ddx4（ Mvh），过去仅被发现在卵母细胞的细胞质中表达。这与更早期的研究明显相互矛盾。利用当前最新见的荧光激活细胞分选技术，MGH-Vincent研究小组证实，标记蛋白Ddx4确实存在于卵母细胞中，但它还表达于某种罕见的卵巢细胞的表面。这样导致了OSCs受到了其他细胞类型的污染。） |
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答：MVH/Ddx4是生殖细胞特异性标志物，因此使用MVH分离到的来自出生后小鼠卵巢细胞是由雌性生殖干细胞(FGCS, OSC)和少量卵母细胞组成的生殖细胞。由于卵母细胞在体外并不能长期存活，在我们的培养条件下，两周内所有的卵母细胞都会死亡，因此得到的都是能够自我更新的雌性生殖干细胞。由于Tilly课题组所用的方法和我们的方法基本是一致的，因此Tilly课题组的这篇论文的发表是对我们工作的进一步验证，而并不会影响我们原有的结论。 |
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问题3：原作者还提及，“Additionally, although the Chinese team had transplanted OSCs into ovaries of mice previously treated with chemotherapy, the MGH-Vincent team showed that it was not necessary to damage the recipient mouse ovaries with toxic drugs before introducing OSCs”（此外，中国的研究小组将在将OSCs移植到小鼠卵巢前，采用了化疗处理，MGH-Vincent研究小组证实在导入OSCs前并无必要用有毒药物来损害受体小鼠的卵巢） |
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吴教授答：Tilly课题组做的研究，之所以没有进行药物处理，是因为他们的实验涉及到了人并且不能因实验而在人的身上进行化学药物处理。他们和我们都是通过用反转录病毒将GFP标记到生殖干细胞上，然后将干细胞移植到受体卵巢中，我们的实验通过药物杀死生殖细胞后，植入的生殖干细胞能够在受体小鼠卵巢内定植并形成GFP阳性的卵母细胞，这样就更加能证明这些形成的卵母细胞是来源于我们移植的细胞。总之，我们和Tilly课题组得到的结论是一致的，只是因为我们是首次移植，所以为了更加确认实验结果才采取了药物注射来清除受体原有的生殖细胞，而Tilly课题组不注射药物是因为涉及到人类实验所以才没有注射药物，两者之间并没有矛盾, 结论是一样的。 |
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问题5：在另外一篇外文新闻
（http://the-scientist.com/2012/02/27/ovarian-stem-cells-in-humans/）中，也有研究人员对最新这项成果提出了质疑，认为“While the results provide the first good evidence that women may produce eggs into adulthood, not everyone is ready to begin modeling the ovary after the testes……uibbles with Tilly’s assertion that the OSCs he’s isolated are ‘mitotically active’”（尽管研究结果首次提供了证据证明妇女直至成年期都能生成卵细胞，然而却没有人在这些测试后对卵巢建模。PrimeGen的一位生殖生物学家Fari Izadyar曾帮助过研究小组从卵巢中分离出干细胞，Izadyar质疑Tilly分离的OSCs是否是有丝分裂活性期的细胞。Izadyar不确定这些细胞正在进行分裂，更别提继续补充卵母细胞群。） |
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吴教授答：关于其他科学家对于雌性生殖干细胞的有丝分裂能力的质疑，我们觉得最好的回答就是充分的实验证据。我们课题组早已在2009年发表在Nature Cell Biology的工作中从mRNA水平，蛋白水平和细胞水平都已证实，我们所建立的雌性生殖干细胞系确实具有有丝分裂活性。关于雌性生殖干细胞存在于出生后哺乳动物和人类卵巢是不容置疑的事实。 |
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问题6：据生物通了解，您的研究组是第一个提出并用Ddx4因子筛选并分离出OSC的，Tilly在发表的文章中是不是其实同样沿用了您开创的分离方法和思路，只是略加修饰呢？ |
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吴教授答：是的. 我们是第一个提出并用Ddx4/MVH因子筛选并分离出雌性生殖干细胞的。 Tilly课题组在2012年Nature Medicine发表的文章中其实是按我们开创的分离方法和思路，只是略加修饰。 |
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问题7：可否这么说：其实这篇文章应该说在您研究组创立的方法的基础上进行完善，也就是说再次证实了您创立的分离OSC的方法可行，且可以用于人类OSC的分离，只是还需要完善？ |
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吴教授答：是的。 |
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问题8：最新这篇Nature Medicine论文在小鼠和人类细胞中都进行了实验，您认为造成这两项成果差异的原因是否是由于人类细胞与小鼠细胞的差别？原文作者提及其文章第3个重要意义在于首次从人分离出OSC细胞。您的小组在2009年之后有没有做过人细胞的实验？为什么？一般人都认为在中国大陆地区的伦理管制相对较为宽松，您认为在研究中有哪些困难？ |
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吴教授答：我们课题组经过多年漫长的探索，创建了小鼠雌性生殖干细胞的分离，純化, 鉴定和体外建系方法，从而首次阐明从成年哺乳动物卵巢内能够分离出具有自我更新和分化潜能的雌性生殖干细胞并定位该细胞为卵巢皮质表面而不是卵巢柱状上皮表面（Nature Cell Biology，2009; 11: 631-636 ）。我们随后的工作包括利用雌性生殖干细胞创建了高效、快速、经济、简便的转基因和基因沉默动物模型方法（Journal of Molecular Cell Biology，2011; 3: 132-141），以及辨认了另外一种用于雌性生殖干细胞分选的特异性蛋白Fragilis，大大提高了分选效率（Stem Cell and Development, 2011; 20: 2197-2204）。 Tilly课题组的工作在很大程度上是基于我们2009年发表在Nature Cell Biology的工作，扩大到用于人类的研究，人和小鼠有很高程度的相似，但也存在着一些细节上的区别。我们课题组其实早就开展了人类雌性生殖干细胞的研究，并取得了一定的进展，但由于未获得较大的支持和重视等，使该研究落后于Tilly课题组。一方面我们对Tilly课题组所取得的成果表示祝贺，另一方面也为我们的工作进展比他们慢一步表示非常的遗憾。 |
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问题9：联系到生物通早期报道过，几年前研究人员就发现骨髓或血细胞移植可以重新恢复化疗导致生育力丧失的成年雌性小鼠的卵母细胞生成能力，您认为这种作用是通过骨髓干细胞直接分化的，还是骨髓移植某种因子刺激卵巢中的OSC，生成卵母细胞的呢？Tilly等人表示希望不引入遗传物质的情况下能“激活”老年妇女的“失去功能的”卵子，最终能实现恢复生育能力，您认为前景如何？ |
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吴教授答：“发现骨髓或血细胞移植可以重新恢复化疗导致生育力丧失的成年雌性小鼠的卵母细胞生成能力”的工作应该是Tilly课题组在2005年发表在Cell的工作。他们的工作证明成年小鼠卵巢中具有增殖活性的生殖细胞来源于骨髓或血细胞 （Cell 2005，122: 303-315 “These results identify BM (bone marrow) as a potential source of germ cells that could sustain oocyte production in adulthood”）。
对于这种作用是通过骨髓干细胞直接分化的，还是骨髓移植某种因子刺激卵巢中的OSC，生成卵母细胞的，还需进一步实验分析。 |
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问题10：在这些研究中获得的这种生殖干细胞是从卵巢中的具体哪一部位提取出来的？是否采用了诸如免疫组化等方法确定了这些细胞在卵巢中的定位？OSC的定位将有助于揭示其生理功能。您认为OSC的潜在生理功能是什么？在那些情况下能让“她们”恢复生产生殖细胞的能力？ |
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吴教授答：小鼠雌性生殖干细胞是从卵巢皮质的表面分离到的，是先通过体内的BrdU/MVH免疫荧光双标记实验进行定位，然后再通过MVH或者Fragilis进行分选。雌性生殖干细胞的生理意义就是对卵巢内的生殖细胞进行补充，具体调控机制需进一步实验证明。 |
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问题11：您的研究组的工作具有重要意义，将能改写教科书内容，假如能找到一种方法激活OSC，妇女能持续排卵，那是不是说，就不会有更年期的问题？女性将可以再获得更多青春？ |
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吴教授答：每种干细胞在体内都受到微环境的调控，在没有完全弄清楚调控机制之前应该尊重正常的生理规律，不应该人为的干扰干细胞的生理特征，否则不仅可能不利于健康，而且甚至会有形成肿瘤等疾病的风险。因此，如果用于抗衰老必须在弄清楚调控机制之后才能进行。 |
