生物通报道：遗传学家一直在利用包括从家鼠到单细胞酿酒酵母在内的多个模式动物，研究调控人类发育与生理的基本生物过程，以及这些生物过程在各种疾病中出现的变化。

因为调控人体这些生物过程的基因在其它物种中具有类似的功能，而且模式生物体中的基因可以随意在实验室中突变和删除，所以这一概念是成立的。但是迄今为止，即使在易于操作的酵母中，基因也必须是一次删除一个，而且这会在基因组中留下一些不需要的序列修饰。

来自哈佛大学Wyss研究所的George Church领导的一个研究组提出了一个新的基于CRISPR-Cas9的技术方法，可以解决这两个问题。

具体来说，研究人员利用酵母开发了一种高通量方法，能够在单个酵母细胞中同时精确改变数百种不同基因或者某个基因的多个特征，效率达到80％至100％，这能帮助研究人员从群体中筛选出显示特定行为的细胞，并确定启动或抑制它们的基因改变。

这一研究成果公布在Nature Biotechnology杂志上。

Church表示，“我们的方法不仅提供了一种比之前方法更高效，更准确的方法来完成酵母中的高通量‘功能基因组学’研究，而且还可以模拟和测试酵母细胞中细微的人类基因变异与某些特征或疾病之间的松散关联，并找出哪些实际上具有相关性的。”

人类基因的突变通常不会像基因组序列那样完整删除，而是由小的点突变组成，也就是在DNA编码中替换单个A，T，C或G碱基单位，以及插入或删除几个基本单元。为了在不存在其它潜在干扰性变异的情况下，重新构建酵母基因组中的这种突变，研究人员利用CRISPR-Cas9，通过指导RNA（sgRNA）精确靶向DNA中的预选序列。在Cas9酶切割其靶序列后，称为同源性定向重组（HDR）的生物过程可以利用外部提供的供体模板序列（携带感兴趣突变）来修复基因。

“我们提出了一种新方法，将sgRNA和供体模板与一个稳定且可遗传的染色体外DNA分子（guide + donor）连接起来，从而能够在一个反应​​中构建大型变体文库，提供多种相应的sgRNA，供体模板集中在酵母细胞上，并通过新一代测序鉴定那些刺激某些细胞行为的突变，“文章一作之一，博士后研究员Xiaoge Guo博士说。

在概念验证性研究中，研究人员首先聚焦于编码DNA解旋酶和修复酶SGS1的单个高保守基因。然后他们用有毒试剂破坏携带guide+donor文库的酵母细胞的DNA，并对存活细胞的DNA进行测序。从中研究人员能发现影响SGS1特征的突变，这些特征对于修复受损的DNA至关重要，并能保证细胞的持续存活。

接下来，研究人员利用这种guide+donor方法删除了一个了解甚少的基因家族的成员，这一基因家族编码所谓的小开放阅读框（smORF），smORF散布在整个基因组中。

他们分析酵母细胞在不同环境胁迫条件下的存活情况，可以将以前未知的基本功能指向特定的smORFs，从而为研究开辟了一个新的大门。

“使用这种方法，除了能找到基因和基因家族的新功能外，一个有趣的应用就在于可以研究基因组中的非编码序列，有助于加深我们对基因调控和染色体生物学的理解，”文章另外一位作者Alejandro Chavez说。

此外，研究人员还表示，还可以将guide + donor方法应用于合成生物学，设计具有特定代谢和工业相关能力的酵母细胞，或将其转移到病毒酵母菌株中，发现影响其传染性质的基因和基因功能。

这项研究为CRISPR-Cas9技术的最新应用开辟了另一条途径，即发现先前未知的细胞调节其生理学的分子机制。

（生物通）

作者简介：

George Church（乔治•丘奇）博士，男，1954年出生，哈佛医学院遗传学系教授，哈佛大学/麻省理工学院HST联合研究所教授。他还是Broad研究所的成员，哈佛Wyss研究所的创始立者之一，以及个人基因组计划(Personal Genome Project)的创始立者及总监。Church教授拥有哈佛大学生物化学和分子生物学系博士学位，1986年被聘为哈佛医学院教授。2017年10月被授予复旦大学生科科学学院荣誉教授。

美国科学院院士，美国工程院院士，富兰克林·鲍尔科学成就等，2017年，Church教授被“时代”杂志评选为世界上最具影响力的100个人之一。

原文标题：

High-throughput creation and functional profiling of DNA sequence variant libraries using CRISPR–Cas9 in yeast