论文标题：N6-methyl-adenosine (m6A) marks primary microRNAs for processing
刊登日期：2015年03月
发表杂志：Nature
影响因子：40.1
研究机构：美国洛克菲勒大学
技术手段：m6A-seq，小RNA芯片，细胞敲低和过表达，qRT-PCR等

1.摘要

在miRNA生物合成的第一步是在微处理蛋白复合物的帮助下对初级microRNA（pri-miRNA）进行加工。微处理蛋白复合物由RNA结合蛋白DGCR8和III型核糖核酸酶Drosha组成。这个起始事件需要DGCR8识别pri-miRNA发夹上茎和侧翼单链RNA的连接处，并招募Drosha剪切双链RNA产生前体miRNA（pre-miRNA）。pri-miRNA的加工机制已经被阐释，但是目前并不知道DGCR8在众多具有二级结构的转录本中识别和结合pri-miRNA的机制。

本研究中，洛克菲勒大学Dr.Tavazoie教授的课题组发现在哺乳动物细胞中，METTL3会使pri-miRNA发生甲基化，标记的pri-miRNA可以被DGCR8的识别和加工。通过miRNA芯片分析发现，敲低METTL3会降低DGCR8与pri-miRNA的结合作用，引起成熟体miRNA表达量降低，通过未经加工pri-miRNA含量增加。体外实验证实m6A会促进pri-miRNA的加工。最后，功能验证实验揭示METTL3能够促使miRNA成熟。

本研究结果表明，m6A标记是一个关键的转录后修饰，会促进miRNA生物合成的起始。

2.METTL3直接介导pri-miRNA加工

这篇文章的作者在先前的研究中已经证实，转录后的碱基修饰能够调控miRNA的加工过程。作者通过FIRE算法在pri-miRNA中找到了高丰度GGAC motif。这种motif与许多已发表的文献中METTL3识别的RGAC motif很相似。与很多pri-miRNA相反的是，这种motif并没有在miRNA前体序列（pre-miRNA）中富集。

接下来为了证实这种现象是否与METTL3酶相关，作者对乳腺癌细胞系MDA-MB-231使用了m6A-seq（也叫MeRIP-seq）测序，在m6A靶向的pri-miRNA上发现了许多GGAC motif。根据m6A-seq结果搜寻顺式调控元件发现METTL3 motif显著富集。

此外作者使用IGV软件发现，pri-miRNA上被reads覆盖程度较高的区域基本都是METTL3的motif并用绿色的小点标记了出来。

为了证实METTL3是否真的参与miRNA加工过程，作者在细胞系中使用两种短发卡RNA（short hairpin RNA）对METTL3进行干扰并用control shRNA进行对照，然后使用小RNA微流体芯片统计细胞中miRNA整体的表达情况。接下来作者发现miRNA成熟体整体表达量显著下调。此外，METTL3敲低后对miRNA在基因组不同位置上的影响呈现一定的多样性，内含子比例最高，接下来是基因间区。

作者对几个关注的miRNA进行qPCR验证，发现受METTL3敲低影响，miRNA表达量显著下调。

另外，METTL3敲低在多种哺乳动物的细胞系中都存在相似的情况，即miRNA表达量都显著下调。所有结果表明，METTL3无论在肿瘤细胞系还是常规细胞系中都对miRNA表达产生很大的影响。

为了验证METTL3是否真正影响miRNA加工，作者在细胞系中转入METTL3过表达载体。结果表明METTL3过表达能够显著提高细胞系中miRNA的表达水平。

接下来作者发现METTL3敲低后，pri-miRNA表达量显著上升。这个结果表明pri-miRNA加工成pre-miRNA和miRNA成熟体需要METTL3来介导参与。

所以无论是METTL3的敲除敲低，还是过表达后改变了其表达量、细胞中亚定位或微处理蛋白复合物的催化活性。实验结果都表明METTL3直接参与pri-miRNA的加工过程。

3.METTL3直接参与pri-miRNA的m6A甲基化修饰

为了证实METTL3直接参与pri-miRNA的m6A甲基化修饰，作者使用METTL3抗体紫外交联法（CLIP-seq）进行验证。结果表明，与m6A-seq测序相似，METTL3 motif被显著富集。

与m6A-seq测序结果相似，METTL3敲低/敲除后miRNA与METTL3 footprint存在极高的重叠率。

接下来作者采用Phastcons软件对100多种脊椎动物的miRNA以及METTL3 motif进行分析，结果表明METTL3在不同动物中都是极端保守的。

4.METTL3介导m6A修饰参与pri-miRNA加工

为了证明m6A修饰直接参与pri-miRNA的加工过程，作者获得了转染了DGCR8和DROSHA的HEK293细胞提取物。这些提取物被用于验证pri-miRNA是否含有m6A碱基修饰。通过Northern blot实验发现，发生甲基化的pri-let-7比未发生甲基化修饰的pri-let-7通过微处理蛋白复合物作用后产生pre-let-7的效率会更高。这个实验说明m6A甲基化修饰对于pri-miRNA加工成pre-miRNA这一过程至关重要。

接下来，作者对pri-miRNA上容易发生m6A修饰的腺嘌呤苷酸（位于METTL3 motif中的A）进行点突变。已知pri-let-7e上一共含有五个腺苷酸（A），作者分别将五个A全部进行点突变。实验结果表明，这些被突变的METTL3 motif（也叫作腺嘌呤苷酸A）能够显著降低pri-miRNA加工成熟体miRNA的效率。

5.METTL3和DGCR8形成复合物参与pri-miRNA加工 

免疫共沉淀实验表明METTL3和DGCR8属于蛋白复合物中的一部分。但是两者相互作用需要RNA介导，在RNase消化酶的作用下，两者不能相互结合。接下来作者想要验证DGCR8是否与发生m6A甲基化的RNA相结合，使用紫外交联法分离出DGCR8。对DGCR8免疫共沉淀后，m6A免疫印迹法实验证实DGCR8确实能够与发生m6A甲基化的RNA相互结合。对METTL3敲除/敲低后能够显著降低RNA甲基化水平从而降低DGCR8和RNA结合水平。但是，DGCR8与发生甲基化的RNA并不是直接相结合的，作者通过实验验证DGCR8与甲基化RNA和非甲基化RNA相结合并没有偏好性。

6.DGCR8特异性识别m6A甲基化pri-miRNA

mRNA非常容易形成类似于pri-miRNA一样的二级结构。为了证实DGCR8是否真正能够特异性识别pri-miRNA而不是mRNA二级结构这个猜想，作者想要通过降低pri-miRNA的m6A甲基化水平，从而验证DGCR8蛋白结合的RNA总量是否所有下降。接下来，作者对细胞中的METTL3进行了敲除，并将所有的RNA进行放射性标记。DGCR8免疫共沉淀实验，METTL3敲除后DGCR8结合的RNA总量和pri-miRNA总量都显著降低（放射性信号减弱）。这些实验结果证实，发生m6A甲基化的pri-miRNA能够被DGCR8特异性识别，并影响后续成熟体miRNA的加工。

7.总结

本文通过上述一系列严谨的实验，首次证明了m6A甲基化修饰是参与miRNA加工过程的一种新型调控方式。METTL3能够对pri-miRNA上GGAC motif的腺苷酸（A）进行m6A修饰。RNA甲基化修饰能够促进pri-miRNA被DGCR8特异性识别，从而成为miRNA成熟体加工过程中的一个十分重要的marker。所以作者认为m6A是一种十分重要的RNA标记，这种标记能够介导激活下游的微处理蛋白复合物，从而启动pri-miRNA向pre-miRNA和成熟体miRNA等一系列加工过程。因此m6A这种特殊的标记在细胞核中具有重要的作用，即允许微处理蛋白复合物识别具有特定二级结构且发生甲基化的pri-miRNA而不是其他一些底物如具有二级结构的mRNA等。此外，作者也推测METTL3的异常表达可能会引起肿瘤中miRNA的异常高表达。