Cas9加纳米孔测序,CATCH你感兴趣的区域

【字体: 时间:2018年07月09日 来源:生物通

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  以色列特拉维夫大学的研究人员最近将Cas9靶向克隆与纳米孔测序结合,有望鉴定出复杂的疾病相关区域或高度可变的基因组区域。他们使用一种名为CATCH的新技术,分离出与乳腺癌相关的BRCA1基因,并开展纳米孔测序分析。

  

以色列特拉维夫大学的研究人员最近将Cas9靶向克隆与纳米孔测序结合,有望鉴定出复杂的疾病相关区域或高度可变的基因组区域。他们使用一种名为CATCH的新技术,分离出与乳腺癌相关的BRCA1基因,并开展纳米孔测序分析。

技术路线

研究人员从人外周血原代细胞中提取出200 kb的DNA片段(包含了80 kb的BRCA1基因及其邻近的区域),并对这些片段进行长距离扩增。在充分富集了200 kb的目标序列后,研究人员开始进行纳米孔测序,这让他们能够了解感兴趣片段的核苷酸序列,探索编码和非编码区域。

研究人员认为,能够提取、扩增和分析200 kb的片段,大大加速了人类基因组的探索。“由于测序成本高,我们只能从基因组中挑出感兴趣的区域,将测序精力和经费放在这一部分上,而不是将测序片段‘浪费’在基因组的其他部分,”特拉维夫大学的Yuval Ebenstein教授说道。

目前,基因组测序的技术有很多,包括单分子实时(SMRT)测序、纳米孔测序,以及广为流行的新一代测序(NGS),以Illumina测序为代表。尽管这些方法很高效,但它们都存在限制。

NGS的限制在于无法处理比较大的结构畸变。SMRT和纳米孔测序能够检测NGS无法检测的变异,并且能实时查看数据。纳米孔测序还能分析天然的DNA,而不需要PCR扩增步骤。这是一个很大的优势,因为PCR扩增过程往往会引入更多的错误和SNP。话虽如此,纳米孔测序还要不断努力以实现更高的准确性,而NGS在这方面经受住了考验。

Ebenstein博士指出,尽管纳米孔测序能够使用天然的DNA,但CATCH只分离基因组的一小部分,这意味着文库制备时只需要极少量的DNA。当下,人们必须从大量细胞中分离DNA或扩增,才能得到足够测序使用的起始材料。

值得一提的是,CATCH(Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments)技术是由Ebenstein博士联合清华大学生命科学学院研究员朱听以及中科院微生物所研究员娄春波共同开发的。2015年,他们在《Nature Communications》上发表了这一成果。

现在与未来

尽管纳米孔测序能够读取几百kb的片段,但问题是它还是太贵了。诚然,Oxford Nanopore Technologies MinION测序仪的零售价只有1千美元,不过“尽管前期投入很低,但MinION测序仪上每个碱基的成本仍然远高于NGS,”Ebenstein博士指出。

有了CATCH这种技术,研究人员能够用Cas9切割目标区域两侧的序列,分离和富集一小部分的基因组。这样能够加快整个实验进程,因为纳米孔测序只需要用在感兴趣的区域上,而不是整个基因组。这也是他们希望通过这个实验传达的要点之一。

“CATCH带来靶向且经济的测序,让纳米孔测序离临床更进一步,”Ebenstein博士解释道。“你只需要知道目标区域两侧的序列,就能够富集基因组中那些高度复杂且颇具挑战性的可变区域。”

纳米孔测序因超长读长和实时分析能力而受到广泛关注,现在有了CATCH,整个过程变得更加快速,也更加经济。“纳米孔测序的长读长让人们能够鉴定大的结构变异和小的SNP。这些信息对于了解疾病的遗传基础至关重要,”Ebenstein博士说。

5月,研究小组在《Nucleic Acids Research》上发表了一篇题为“Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH)”的论文,介绍了实验结果。他们表示,NGS发现了177个SNP,而纳米孔测序发现了62%的SNP,而其余的37%不确定。

Ebenstein博士认为,NGS的错误率比纳米孔更低,因此更适合检测单碱基突变。不过,从另一方面来看,CATCH带来的充分覆盖能够克服这些错误,此外,纳米孔测序还能更好地检测大的变异,如结构变异和拷贝数变异。

特拉维夫大学化学院的Yael Michaeli博士提到,研究团队此次使用的软件与NGS序列的兼容性更好,这在某种程度上解释了纳米孔的结果不佳。

显然,纳米孔测序还存在一些不确定性。与竞争对手相比,它在可靠性方面还需要更进一步的证明。不过,Ebenstein博士相信,纳米孔测序将在常规的基因组分析流程中找到自己的位置。当然,它依然比NGS贵,只有在需要的时候才用到。(生物通 薄荷)

原文检索

Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH)

Nucleic Acids Research, gky411, https://doi.org/10.1093/nar/gky411

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