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生物通首页 > 今日动态 > 专题总汇 > 热点关注——m6A甲基化研究指南


       最近关于m6A甲基化的研究，热度持续不减。那么，什么是m6A？如何检测m6A？整体研究思路如何？大牛们又是怎么做的？想必大家都想了解一下。联川生物近日重磅推出m6A研究的技术专题，覆盖m6A的技术介绍、研究思路和案例解读，值得您细细品读。




m6A概念，重磅前沿

       在真核生物中，5’端的Cap以及3’端的ploy A修饰在转录调控中起到了十分重要的作用，而mRNA的内部修饰则用于维持mRNA的稳定性。mRNA最常见的内部修饰包括N6-腺苷酸甲基化（m6A）、N1-腺苷酸甲基化（m1A）、胞嘧啶羟基化（m5C）等。

       当RNA分子腺苷酸上第六位氮原子处发生甲基化时，就是我们所说的m6A。虽然RNA甲基化的研究在上世纪七十年代就开始，但是由于技术上的局限一直停滞不前。直到最近几年在何川教授等研究团队的带领下，通过不断的技术创新和难点攻克，m6A 等甲基化修饰的研究才不断取得突破性的进展。详细内容>>

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如何检测m6A？

       2012年，两篇发表于《Nature》和《Cell》上的论文可以说是第一次从转录水平上高通量地鉴定了人和小鼠m6A的甲基化水平（Dominissini 2012和Meyer 2012）。这两篇独立发表的论文采用的核心方法是将m6A抗体与带有m6A的mRNA片段相结合后进行高通量测序。通过对下机数据的分析来鉴定mRNA上m6A程度较高的区域，分辨率约为100 nt。这种方法我们称之为MeRIP-seq或m6A-seq。

       2015年，部分科学家将m6A的分辨率精确到单碱基的程度，包括miCLIP-seq和SCARLET等（Linder 2015和Fu 2014）。这类方法虽然可以鉴定单碱基的甲基化水平，但由于实验方法中涉及P32等同位素标记加上成本过高，常规实验室不会特意展开此类实验。

       这里主要对MeRIP-seq这项技术的原理做一个简述，方便大家理解如何对m6A区域进行富集和鉴定。文末我们还会对一些实验中比较“坑爹”的雷区，展开讨论。备注部分将会详细讨论可能出现问题的一些环节，这个部分需要重点关注。详细内容>>

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m6A甲基化检测方法及优劣势盘点



手把手教你如何开展m6A实验

       关于m6A甲基化的研究，目前有多种思路可供选择。无论是前期开展预实验还是申请基金，都可以根据下图中的研究流程图展开。下面，我们就以小陈同学的实验为例，带领大家如何一步步开展自己的实验，身临其境地去体验m6A实验的每个阶段所要完成的步骤。详细内容>>



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m6A甲基化的整体研究思路：m6A课题如何设计
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后期验证工具

       你以为做完m6A测序就结束了？当然不是。做完测序后需要对分析结果中感兴趣的内容进行生物学功能验证，一个完整的功能验证将历经分子细胞→细胞功能→动物实验等形成完整的实验思路。其中分子细胞包括RNA-RNA互作验证（如miRNA与UTR互作验证）等。细胞功能包括敲低/敲除/过表达、蛋白细胞定位、蛋白与蛋白互作、蛋白与RNA/DNA互作、细胞表型实验（迁移侵袭、划痕、增殖、凋亡、周期）等。最后的动物实验主要指动物模型实验，如小鼠、斑马鱼等。首先，m6A-IP-qPCR了解一下！详细内容>>

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RNA甲基化m6A后期验证工具（一）
RNA甲基化m6A后期验证工具（二）



    ■  案例解析1：

论文标题：ALKBH10B Is an RNA N6-Methyladenosine Demethylase Affecting Arabidopsis Floral Transition
刊登日期：2017年12月
发表杂志：《Plant Cell》
研究机构：北京大学贾桂芳/何川课题组

在这篇论文中，北京大学的贾桂芳课题组利用拟南芥ALKBH10b（At4g02940）突变体研究去甲基化酶如何对拟南芥开花早期的成花转变进行调控。结果显示，ALKBH10b通过介导FT, SPL3和SPL9的去甲基化修饰，并且证实幼年期→成年期关键分子miR-156不参与调控该通路，而是ALKBH10b特异性地调控拟南芥成花转变过程。详细内容>>

延伸阅读：
m6A调节果蝇性别分化和神经功能

    ■  案例解析2：

论文标题：m6A-dependent maternal mRNA clearance facilitates zebrafish maternal-to-zygotic transition
刊登日期：2017年2月
发表杂志：《Nature》
研究机构：美国芝加哥大学何川课题组

在这篇论文中，来自芝加哥大学的何川教授课题组发现，胚胎中超过三分之一的母源mRNA上存在m6A修饰，这些mRNA之后会被YTHDF2清除。YTHDF2一旦被敲除后，带有m6A修饰的母源mRNA的半衰期显著上升，合子基因组激活受阻。这些胚胎无法及时启动MZT，细胞周期发生中止从而导致斑马鱼子代发育延缓。详细内容>>

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m6A调控miRNA初级体识别加工



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