如何快速发现肿瘤特异性外泌体RNA分子标志物
【字体： 大 中 小 】 www.yiwulimax.com 时间：2017年3月21日 来源：表观生物
摘要：
外泌体所携带的这些 RNA 统称为外泌体来源 RNA，具有完整的序列结构和生物活性，有望作为液体活检分子标志物诊，在精准医学发展上有着光明的前景。表观生物技术团队结合最新的高通量测序技术和生物信息分析方案，倾力打造外泌体RNA分子标志物开发的转化医学整体解决方案！
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在当前精准医学的大背景下，液体活检作为一项重要的创新技术，有望在癌症早期筛查与诊断、治疗方案指导、疗效评估及预后测评领域发挥作用，具有极高的临床应用价值和市场前景。液体活检主要包括检测血液中游离的循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)、循环肿瘤DNA (circulating tumor DNA，ctDNA) 和外泌体等。
外泌体为大小30 ～100 nm 的细胞外泌性囊泡，具有脂质双层膜结构。近年研究显示，外泌体是细胞与细胞间通讯的重要的分子，参与诸多生理与病理过程。外泌体中不仅包含蛋白质成分，还包括一些RNA成分，如微小 RNA( microRNA，miRNA) 、长链非编码RNA和mRNA、环状RNA（circular RNA，circRNA）。外泌体所携带的这些 RNA 统称为外泌体来源 RNA，具有完整的序列结构和生物活性，有望作为液体活检分子标志物，在精准医学发展上有着光明的前景。
相比与传统液体活检所检测的cfDNA和CTC，外泌体具有以下优势：
1. 外泌体在体液中具有更高的浓度含量，有利于肿瘤的早期诊断；
2. 外泌体的脂膜结构对所包含的核酸分子起到良好的保护作用，具有更高的稳定性；
3. 外泌体的粒径较小，通透性强，容易到达各种体液中，为液体活检提供重要的前提条件；
4. 外泌体包含丰富的核酸分子，从mRNA、lncRNA和circRNA等大RNA分子层面更容易发现肿瘤特异的分子标志物[1][2]。
表观生物通过反复比较测试多种外泌体的提取技术，最终择优采用Qiagen exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit试剂盒，该试剂盒来源于首个通过FDA批准的外泌体诊断公司--美国Exosome Diagnostics, Inc.的核心技术，能够在25分钟内快速纯化得到细胞外囊泡，并获得更为全面的高纯度RNA分子，适合用于检测外泌体中的环状RNA及其他长片段的线性RNA。 表观生物技术团队结合最新的高通量测序技术和生物信息分析方案，倾力打造外泌体RNA分子标志物开发的转化医学整体解决方案！
项目流程
测序方案
1) 测序平台：Illumina HiSeq X10/Hiseq 4000
2) 测序模式：PE150
3) 测序数据量：>8G/样本
4) 适用物种：人
5) 样本类型：限人血浆（推荐）或者血清，每个样本2-4ml体积
分析内容
1. 去接头污染，去低质量reads和测序质量评估
2. 参考基因组比对
3. 全基因组reads分布图谱
4. 环状RNA预测
5. 环状RNA表达差异分析
6. mRNA表达差异分析
7. 差异基因KEGG、GO分析
8. 差异lncRNA分析
参考案例
来自复旦大学的科研人员首次发现了exosomes内含有大量circRNA[3]。
研究者从MHCC-LM3肝癌细胞以及此细胞来源的exosomes中分别提取总RNA（去除核糖体RNA），进行RNA-seq分析，发现exosomes中的circRNA比exosomes来源细胞中的circRNA丰富得多。
通过exosomal RNA测序方法，研究者发现人血清exosomes也含有大量完整稳定的circRNA，并且结直肠癌病人血清exosomes中的circRNA与正常人差异明显，肿瘤来源的exo-circRNA有望成为癌症检测的潜在生物标志物。
(G) 血液中外泌体环状RNA在全基因组的位置分布
(H) 血清外泌体环状RNA的序列长度分布
(M) 正常人血清和直肠癌病人血清外泌体环状RNA的表达谱差异比较
(N) qRT-PCR 检测circ-KLDHC10 的表达水平在正常血清和直肠癌病人血清中有明显差异。
参考文献：
[1]Zheng Q, Bao C, Guo W, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs[J]. Nature communications, 2016, 7.
[2]Guarnerio J, Bezzi M, Jeong J C, et al. Oncogenic role of fusion-circRNAs derived from cancer-associated chromosomal translocations[J]. Cell, 2016, 165(2): 289-302.
[3]Li Y, et al,.Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis.Cell Res. 2015 Aug;25(8):981-4.
【关于表观生物】
广州表观生物科技有限公司（简称表观生物 Guangzhou Epibiotek Co.,Ltd.）2016年在广州科学城成立，是由多位归国资深生物技术专家共同创办的高新技术企业。表观生物专注于医学表观遗传与转录调控研究领域，提供尖端的GRO-seq、CLIP-seq、ChIP-seq、外泌体环状RNA测序、Crispr cas9高通量筛选、生物信息分析等科技服务，致力于成为全球领先的表观遗传学研究服务提供商。
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