miRNA（microRNA）是一类极小的非编码RNA，具有多种生物调节功能。由于miRNA一般仅20bp左右，长度仅相当于普通引物，因此给miRNA检测带来较大难度。

Rea-ltime PCR检测由于其高特异性和高效性已经被视为各种核酸定量检测的金标准。尽管miRNA检测的特殊性极大增加了Real-time PCR检测难度，迄今为止，科学家已经研发出了蝎形引物特异性反转录、Taqman探针检测、polyA加尾法等多种方法，成功对pre miRNA，成熟miRNA进行了检测，并且对高度近似的miRNA家族进行有效区分和检测。

在前人工作的基础上，英茂盛业（inovogen）进一步优化了real-time PCR检测miRNA的方法，成功采用双特异性polyA加尾法检测成熟和前体miRNA。该方法与原有的方法相比，实验成本更低、工作流程简便、特异性更高。

双特异性polyA加尾法优点：

▪ 一步完成所有miRNA的反转录
▪ 真实反映miRNA表达水平
▪ 高特异性PCR检测，有效区分相似miRNA

双特异性polyA加尾法工作原理示意图：

 
图1、双特异性polyA加尾法qPCR原理

双特异性polyA加尾法与其他检测方法比较：

双特异性polyA加尾法检测miR371和miR372 5p及3p

我们采用双特异性polyA加尾法检测了人肝癌细胞株中miR371-5p、miR371-3p、miR372-5p、miR372-3p。可以看出该方法对4个miRNA都实现了高特异性扩增和高效检测。

 
图2A：miR371和miR372 5p及3p 熔解曲线分析

 
图2B：miR371和miR372 5p及3p 扩增曲线分析

双特异性polyA加尾法精确检测不同样品中的miR200c 3p表达量

我们提取了4个不同细胞株的样品，采用双特异性polyA加尾法检测了miR200c-3P表达量。在转录的RNA总量和内参U44 Ct值（未显示）基本一致的情况下，miR200c-3P检测结果反映出不同细胞株中该miRNA表达的显著差异。值得注意的是，在其中一个细胞株中该基因表达量很低。在Ct值大于35区域也取得了较准确的检测效果。

 
图3B、miR200c-3P 扩增曲线分析

 
图3B、miR200c-3P 熔解曲线分析

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