引子：有了靶基因，很容易就可开展RNAi研究对基因功能进行深层次解析。然而，当有多个基因可能与研究的表型相关时，逐个基因进行研究已然不是一个科学快速的解决办法。混合干扰文库（ pooled shRNA  library）筛选作为一种高通量基因功能研究工具，使得在一个细胞培养体系中同期对成千上万条shRNA进行条件筛选成为可能。

混合shRNA筛选文库：功能性基因筛选研究策略

RNAi筛选作为一种与时俱进的研究高新技术，大大便捷了研究者们对生物过程和疾病相关表型的分析。全基因组覆盖的shRNA文库已经被普遍商业化，这也大大点燃了科学界用RNAi方法进行研究的热情，然对高通量RNAi后期的复杂数据分析却是另一个极大的挑战。将混合shRNA文库与NGS测序技术完美结合的研究策略，使得高通量RNAi筛选进入了快速分析的崭新时代。

合成型siRNA和shRNA表达质粒的实验室应用已经对基因功能缺失性研究产生了深远影响。然而，之前的研究技术不仅费时费力，而且性能不稳定。如今，RNAi干扰文库已经被商业化且可以沉默基因组上的任何基因。但是siRNA文库适用于基于多孔板的高通量干扰分析，单孔单基因进行干扰筛选，费时费力；shRNA文库不仅可以用于单孔单基因的干扰筛选，而且也可以进行混合竞争性干扰筛选分析（barcode screening），短期内就可以在同一群细胞中进行成千上万种shRNA的同步分析，实验方案更灵活，更便捷。（ Sims D. et al.  High-throughput RNA interference screening using pooled shRNA libraries and next generation sequencing. Genome Biology 2011, 12:R104 ）

高通量基因功能筛选策略：
单孔单基因研究VS混合干扰文库筛选

混合shRNA筛选文库构建

全球有多个研究小组和公司都致力于基因组覆盖范围的shRNA文库的构建工作。下表中汇总了截止到2012年已有的多个shRNA文库的基本情况，包括NKI（Netherlands Cancer Institute）文库、TRC（the RNAi consortium）文库、Hannon-Elledge文库和SystemBio（System Biosciences）文库。这些shRNA文库在文库大小、基因组覆盖度、shRNA序列设计及shRNA表达策略上都差异显著：NKI文库、TRC文库和SystemBio文库都是利用RNA聚合酶III系统表达单纯的shRNA来模拟内源性的pre-miRNA（miRNA前体）进行RNAi；而Hannon-Elledge文库利用RNA聚合酶II系统表达类天然miR30初级转录本形式的shRNA来模拟内源性pri-miRNA进行RNAi。基于此，各shRNA文库都具有各自的特点。（Hu G and Luo J. A primer on using pooled shRNA libraries for functional genomic screens.  Acta Biochim Biophys Sin. 2012 Feb;44(2):103-12）

各shRNA文库性能比较。（本图摘自Hu G and Luo J. A primer on using pooled shRNA libraries for functional genomic screens.  Acta Biochim Biophys Sin. 2012 Feb;44(2):103-12  Table 1）

混合shRNA筛选文库：功能性基因筛选流程

Pooled shRNA文库筛选策略以pooled干扰慢病毒文库转导细胞开始，转导需保证单细胞单shRNA整合。随后，给细胞培养体系施加选择压力，挑选出理想表型（对细胞进行活力筛选、报告基因表达筛选或者行为筛选等，摘自Hu G and Luo J.  Acta Biochim Biophys Sin. 2012 Feb;44(2):103-12）。整合到细胞基因组内的shRNA通过NGS测序进行分析。对于目前已知的基因家族、信号通路及表观遗传学家族的基因，均有商品化的高通量干扰产品套装方便进行混合筛选；对于多个基因家族的基因干扰产品组合套装，可以进行个性化定制。

高通量基因功能筛选流程图：
活力鉴定、报告基因筛查或者行为筛选等，摘自Hu G and Luo J.  Acta Biochim Biophys Sin. 2012 Feb;44(2):103-12

新型混合shRNA筛选文库2014震撼问世：shRNAmir

高通量干扰研究对shRNA提出了更高的要求，即单拷贝shRNA载体整合到基因组上也要有干扰潜能。这才能保证细胞群体以低感染复数（MOI）进行干扰病毒的高通量筛选时每个细胞表达唯一的功能性shRNA。冷泉港RNAi中心实验室负责人Gregory Hannon教授的专利shERWOOD算法（ Knott et al. 2014. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell (2014) ）进行shRNA设计，采用内源性miR30 scaffold表达模式，结合体外强大的sensor assay验证数据佐证（ Fellmann et al.. Mol Cell. 2011 Mar 18;41(6):733-46.），保证每一条设计出来的shRNA都在单拷贝水平上有高干扰效率，且低毒、原生态表达，非常契合混合筛选实验对载体的高要求。目前该项专利技术已经授权transOMIC厂家进行shRNA高通量筛选文库的商业化生产（包括混合shRNA文库及array高通量文库）。

transOMIC部分现有shRNA筛选文库枚举

对于没有NGS测序平台或者NGS数据分析能力不足的客户，transOMIC公司还为这类客户提供数据分析的个性定制服务！如果客户需要帮助分析pooled混合筛选后的结果，仅需将筛选后样本提取的基因组DNA交给transOMIC，后续测序+数据分析，一步到位！更多详情可咨询基因公司或登录http://www.transomic.com/Products/RNAi/Pooled-shRNA-Screening-Libraries/Product-Overview.aspx进行了解。

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