近期，加州大学欧文分校（University of California - Irvine）生态学和进化生物学副教授J.J. Emerson的研究团队在《Nature Genetics》发表文章，利用PacBio长读长SMRT测序技术结合Bionano 光学图谱数据对“A4”品系果蝇进行高质量基因组组装，以前所未有的分辨率识别复杂突变，鉴定出了果蝇基因组中的大量此前从未被发现的遗传结构变异（＞100bp）。在这项研究中所发现的大量隐藏的遗传结构变异，其中大部分变异对果蝇的重要表型都有影响。

一、 基因组组装策略

提取A4品系果蝇 DNA构建SMRTbell文库， PacBio RSII平台测序，测序深度147X，共18.7Gb数据量。

使用PBcR-MHAP和PacBio reads组装DNA草图，再用longest 30× PacBio reads和75× paired-end Illumina reads生成混合组装，最后用finisherSC默认设置生成总组装，然后采用SMRT Analysis v2.3和Pilon v1.3对组装结果进行两次修正。最后用bionano 光学图谱数据对组装结果进行验证。

最终组装A4品系果蝇和ISO1（之前发表的果蝇参考基因组）基因组对比如下表，A4品系果蝇基因组Contig和Scaffold数量更少代表更加连续的果蝇参考基因组。构建A4品系果蝇基因组与Bionano光学图谱几乎完全匹配。

二、 鉴定大量隐藏结构变异

相比于短读长测序，长读长单分子实时测序技术在测定基因中大的结构变异方面具有明显优势。通过A4 and ISO1全基因组（之前发布的果蝇参考基因组）的比对， 共发现1890个大的结构变异（＞100bp），影响碱基数超过7Mb；而＜100bp的变异（SNP和小的Indel）影响碱基数仅1.4Mb。其中85% Inversion ，60% CNV，38%TE Insertion，23% Non-TE Insertion在之前基于70×短读长测序方法中未检测到。

Invisible: 二代测序无法检测到；Visible：二代测序检测到

三、 隐藏结构变异影响重要表型

研究中所发现的大量隐藏的遗传结构变异，大部分对果蝇的重要表型都有影响。长读长测序检测到和药物抗性相关的MRP基因区域存在TE Insertion。

1. Cyp6a17基因缺失提高果蝇的耐寒性

通过比较A4 品系果蝇和ISO1果蝇基因组发现，A4 品系果蝇的Cyp6a17基因发生了缺失。之前研究发现Cyp6a17 基因的敲除能提高果蝇的耐寒性，统计学分析表明A4 品系果蝇(∆Cyp6a17)确实较w1118 (intact Cyp6a1723)果蝇具有更好的耐寒性，进一步验证A4品系果蝇Cyp6a17 基因的缺失。分析非洲和北美各地区果蝇群体中Cyp6a17基因缺失发生的概率更好地阐述了基因水平的变化了推动物物种对环境的适应性。

2. Cyp28d1 、Ugt86Dh基因CNV提高果蝇对尼古丁药物的抗性

研究发现A4品系中两个和对尼古丁药物产生抗性相关的Cyp28d1 和Ugt86Dh基因拷贝数发生变异，后续作者用PCR方法对Cyp28d1基因拷贝数变异进行验证确认。A4品系中Cyp28d1 和Ugt86Dh各有两个拷贝，而ISO1均为一个拷贝，拷贝数增加上调了基因表达，这将有助于解释果蝇如何通过遗传进化提高了对尼古丁药物的抗性。

 
同ISO1相比，A4品系果蝇基因组Cyp28d1基因拷贝数增加

 
同ISO1相比，A4品系果蝇基因组Ugt86Dh基因拷贝数增加

像果蝇这种基因组相对简单的生物都隐藏了如此之多的和表型相关的大结构变异，人类基因组结构变异肯定更加庞大。之前受短测序技术的局限性，大部分大片段结构变异未检测到。当前，PacBio三代单分子测序技术日益成熟，平均读长10 Kb，最长可达70Kb，覆盖均一、无GC偏向性，有效弥补了二代测序技术的不足之处，让研究者得到跨度更大的基因组视图；Bionano光学图谱技术在单分子基因组水平可直观获取长度为Mb级别物理图谱；PacBio 长读长均一覆盖的测序技术与Bionano光学图谱技术两者强强结合为各种类型的大片段结构变异检测带来了新的机遇，让研究者有机会了解二代测序技术无法检测到或者常常被忽视的变异，最快最准地阐述重要表型的分子机制，为医学和农业提供更广阔的研究平台。

原文链接： Chakraborty, M., et al., Hidden genetic variation shapes the structure of functional elements in Drosophila. Nat Genet, 2018. 50(1): p. 20-25.

基因有限公司作为Pacific Biosciences公司中国区独家代理商，自2011年以来将PacBio 第三代单分子实时测序技术引入国内,一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培 训,技术支持,应用培训与售后维护工作,赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将 一如既往的支持越来越多的PacBio用户。

立即索取PacBio 长读长测序技术与Bionano光学图谱技术的更多资料