在高通量测序的市场上，Illumina已经领先了很多年。随着仪器、试剂和耗材的不断改进，测序仪的产量不断翻番。然而，Illumina平台有一个主要缺点：读长短，大约在150-250 bp，这为复杂基因组的比对和组装带来挑战。于是，《GEN》杂志聚焦了近年来新兴的长读长测序技术。

在过去的五年里，一些能够提供长读长的新技术兴起，尽管价格较高，但为研究人员提供了全新的基因组分析策略和工具。其中，这个市场上的两个重量级人物是Pacific Biosciences（PacBio）和Oxford Nanopore Technologies（ONT）。

对从头测序项目而言，短读长并不理想，因为长读长的拼接会更容易，这就像100块的拼图比1000块的轻松很多。短读长技术不可避免地漏掉一些结构变异。最近的一项研究表明，大多数（~77%）的插入被短读长检出算法所忽略。

相比之下，长读长则是研究结构变异、拷贝数变异（CNV）以及DNA-蛋白相互作用的更佳选择。根据PacBio开展的一项研究，长读长更好地捕获了基因异构体。不过，有一点需要注意：大多数软件工具都是为短读长开发的，因此数据分析的工作也许颇具挑战性。

测序平台的比较

PacBio的单分子性质意味着它有着与Illumina不同的数据错误模式。SanDiegOmics的顾问Shawn Baker表示：“一方面，原始错误率非常高（>10%），而Illumina大约是0.5-1%。另一方面，这些错误大多是随机的，这意味着通过数据过采样，一致序列错误率可能非常非常低。”

与之相比，Thermo和Illumina平台的系统错误率更高，过采样有帮助，但只是在一定程度上。Baker表示：“实际上，这意味着PacBio能够对其他平台难以处理的基因组区域进行测序。PacBio的主要缺点是每Gb的成本高，目前比Illumina高5-10倍。”当然，PacBio也在努力提高产量。

2017年发表在《F1000Research》杂志上的一篇论文比较了PacBio和ONT的工具。在这项研究中，研究人员利用两种工具来鉴定转录组。他们的结论是，PacBio测序仪产生了更优质的数据，而ONT工具带来了更高的产量。

不过，PacBio的首席科学家Jonas Korlach博士认为，PacBio和ONT的工具不应该直接比较，因为每个实验并不完全相同。“ONT不再使用2D ONT reads，因此其他人员无法重复这项工作。PacBio的工作也没有采用最新的Sequel系统。简单地说，PacBio的结果严重过时，这使得研究产生了偏差。”

Baker也承认，目前没有太多的测序平台正面比较研究。主要的问题之一可能在于论文发表的时间。“论文发表的时候总是过时的，”Baker指出。

手掌上的测序

如果有任何技术有望打破Illumina的垄断地位，很多评论员认为是纳米孔测序。尽管其他公司（包括罗氏和日立）也在开发纳米孔系统，但此领域最知名的公司是ONT。

ONT最为人熟知的是便携式的MinION测序仪，它与智能手机一般大，通过USB连接到笔记本电脑。更高端的台式测序仪PromethION则包含48个流动槽，提供更高产量。该公司的首席技术官Clive Brown表示：“PromethION的产量高于NovaSeq。同时，它的读长非常长，可开展实时分析，并直接读取RNA和DNA修饰，所有这些只需要一小时或更短的样品制备。”

ONT的技术能够产生非常长的连续序列。去年11月，澳大利亚Garvan医学研究所的James Ferguson宣布，他的团队已实现了970 Kb的读长记录。一个月后，他的同事Martin A. Smith宣布读长超过1 Mb。这个记录似乎在不断打破。

此外，MinION的价格很低，仅为1000美元。其他测序仪的售价最低也要5万美元，最高的则达到百万美元。今年1月，Illumina推出了新型的测序仪iSeq 100，零售价低于2万美元，可以在20小时内测序1 Gb。

尽管读长有优势，但MinION尚不具备与Illumina抗衡的通量。不过，它的便携性也是其他平台无法比拟的。目前，它已用在各种应用中，从非洲和南美洲的病毒追踪，到国际空间站的科学实验。它还有一个新的应用，称为“MinION sketching”，能够快速鉴定细胞系和组织，解决目前科学研究中的重复性问题。

Baker表示：“此平台的缺点在于错误率，尽管在不断改善，但仍然高于Illumina的金标准。此外，虽然单次运行的价格低廉（低至500美元），但每Gb数据的成本仍然很高。”此外，ONT也承认其工具经常会错过均聚物，而PacBio的工具不会。

当然，纳米孔测序领域还在不断地发展。今年年初，英国诺丁汉大学的研究人员利用MinION测序仪进行人类基因组的组装。他们随后利用一种nanopolish软件工具来清理组装结果。将序列与Illumina数据进行比对，可进一步提高读取的准确性。利用这些数据，研究人员填补了人类参考基因组中的12个缺口。

研究人员认为，在这么小的设备上生成了这么大的数据集，这是一项了不起的壮举。

原文检索

Sequencing Goes Long

March 01, 2018 (Vol. 38, No. 5)