今天的文章将围绕m6A甲基化检测方法展开，详细阐述m6A甲基化检测方法的具体步骤及优劣势，一起来学习吧~

最早发现的RNA甲基化修饰包括假尿苷和5mC等。在mRNA中，常见的修饰包括m6A、m1A、5mC等。早在上世纪70年代，人们已经在真核生物的mRNA和lncRNA中发现了m6A修饰。但是受到技术手段的限制，检测m6A尤其是对m6A进行定量，甚至是从单碱基水平鉴定m6A，一直进展缓慢。随着高通量测序技术（next generation sequencing, NGS）的发展以及液相色谱灵敏度的提高，科学家们在此基础上发展了多种m6A检测方法。

目前检测m6A所用的技术手段包括高通量测序、比色法以及液相色谱质谱联用（LC-MS），具体方法包括MeRIP-seq、miCLIP-seq、SCARLET、LC-MS/MS等。下面就来介绍目前较为主流的四种检测m6A的方法，其中LC-MS/MS和比色法能够检测mRNA整体的m6A水平，而m6A-seq和miCLIP-seq属于高通量测序手段。

1．LC-MS/MS

图1 LC-MS/MS检测RNA中m6A水平分析流程图

LC-MS/MS在液相质谱的基础上采用串联质谱，能够获得分子离子峰和碎片离子峰，可对碱基同时进行定性和定量分析。

如图1所示，第一步使用TRIzol提取完Total RNA后，既可以用oligodT磁珠对mRNA进行富集，也可以使用rRNA去除试剂盒获得包括mRNA、lncRNA等在内的RNA。第二步使用核酸酶P1（Nuclease P1）将RNA从单链消化成单个碱基。第三步加入碱性磷酸酶和碳酸氢铵后孵育数小时，将样本注射入液相色谱仪，根据出峰的保留时间面积计算各个碱基的含量。第四步进入质谱串联分析，单个核糖核苷酸会被离子化，同时被打断成五碳糖和嘧啶或嘌呤，最后根据出峰的保留时间计算m6A的面积。最后根据m6A和总腺嘌呤的比例就能算出m6A在mRNA上整体的甲基化程度。

2．比色法

 图2 m6A甲基化定量试剂盒流程展示及结果

比色法与LC-MS/MS比较相似，也是从整体水平上检测RNA上m6A甲基化水平。相对于LC-MS/MS较为繁琐的操作，比色法更为简便。研究人员既可以提取total RNA，也可以利用oligodT磁珠富集mRNA。Epigentek公司推出的这款名为EpiQuik M6A RNA Methylation Quantification Kit试剂盒其核心原理与ELISA反应类似，经过优化后检测m6A灵敏度会更高。

3．m6A-seq

 图3 MeRIP-seq（m6A-seq）与miCLIP-seq实验流程

2012年之前，几乎没有从全基因组或全转录组水平上鉴定m6A修饰的文章。之后两篇独立发表的论文第一次从转录水平上，大范围、高通量地鉴定了人和小鼠m6A的甲基化水平。这种方法被称为MeRIP-seq或m6A-seq。

如图3所示，第一步先对mRNA进行片段化，接下来使用带有m6A抗体的免疫磁珠对发生m6A甲基化的mRNA片段进行富集，然后将富集到的mRNA片段纯化后构建高通量测序文库进行上机测序。另外需要单独构建一个普通的转录组文库作为对照。最后将2个测序文库放在一起进行生物信息学分析，得到m6A甲基化程度较高的区域，也叫做m6A peak。

这种方法优点是方便快捷成本低廉，可以对发生高甲基化的mRNA区域进行一个定性分析。但是MeRIP-seq只能鉴定m6A高甲基化的区域，并不能做到单碱基的分辨率。送样要求建议为肝脏、脑等转录较为活跃的组织，如果细胞样本建议1x10⁹的细胞量（约为8板细胞以上）。最后总RNA含量推荐在800ug以上，mRNA富集在10-30ug以上才会进入下游实验。

4．miCLIP-seq

已知miCLIP-seq等方法能够对m6A做到单碱基的分辨率。这种方法也会用到m6A抗体，但是会使用紫外交联的方法进行免疫共沉淀。

如上图3所示，第一步依旧是对富集完的mRNA进行片段化。第二步，使用带有m6A抗体免疫磁珠与带有m6A的mRNA片段进行结合。第三步，使用紫外交联进行免疫共沉淀后，在mRNA片段的3’端连上接头序列，在5’端加上P32放射性标记后进行移膜。第四步，根据放射性标记进行切膜回收后，对mRNA片段进行反转录和纯化回收。第五步，对反转录组的cDNA进行环化。第六步，对环化的cDNA进行复线性化，然后构建测序文库上机测序。在这里采用P32放射性标记属于非必须选项。

今天的内容讲完啦，大家记得收藏好慢慢学习哦~

下期预告：m6A甲基化整体研究思路之m6A甲基化课题设计