在上一篇文章《RNA甲基化修饰——m6A概念》中，我们回顾了RNA上的碱基修饰，尤其是m6A甲基化修饰的一些基础知识。由Writers、Erasers和Readers参与调控m6A这种可逆的甲基化修饰，与许多重要的生物学功能息息相关。那么今天我们就来聊一聊如何检测m6A甲基化，尤其是借助近几年兴起的高通量测序技术。

截止2017年已发表的论文中，m6A的检测方法五花八门。实际上，上世纪70年代，科学家已经在RNA中发现了m6A这种甲基化修饰。只不过受限于检测条件和工具，相关研究并没有大范围展开。何川教授在其2014年发表于Nature Reviews Genetics上的一篇综述曾写到“Genome-wide distribution of m6A was unknown before 2012”。

2012年之后，两篇发表于Nature和Cell上的论文可以说是第一次从转录水平上，大范围高通量地鉴定了人和小鼠m6A的甲基化水平（Dominissini 2012和Meyer 2012）。这两篇独立发表的论文采用的核心方法就是将m6A抗体与带有m6A的mRNA片段相结合后进行高通量测序。通过对下机数据的分析，来鉴定mRNA上m6A程度较高的区域，分辨率约为100nt。这种方法我们称之为MeRIP-seq或m6A-seq。

2015年后，部分科学家将m6A的分辨率精确到单碱基的程度，包括miCLIP-seq以及SCARLET等（Linder 2015和Fu 2014）。这类方法虽然可以鉴定到单碱基甲基化水平，由于实验方法中涉及P32等同位素标记加上成本过高，常规实验室不会特意展开此类实验。

本文主要对MeRIP-seq这项技术的原理做一个简述，方便大家理解如何对m6A区域进行富集和鉴定。文末我们还会对一些实验中比较“坑爹”的雷区，展开讨论。备注部分将会详细讨论可能出现问题的一些环节，这个部分需要重点关注。

MeRIP-seq建库步骤：

1. 提取total RNAs，并用Oligo-dT磁珠对total RNAs带有polyA的mRNA进行富集（备注1）。

2. 对磁珠进行富集，得到带有polyA的mRNA。之后加入片段化试剂，将完整的mRNA进行片段化。或者使用超声波仪直接进行片段化（备注2）。

3. 将片段化后的RNA分成两份。一份加入带有m6A抗体的免疫磁珠，对含有m6A甲基化的mRNA片段进行富集（备注3）。另一份作为control，直接构建常规的转录组测序文库。

4. 对m6A抗体免疫磁珠进行富集，带有m6A的mRNA片段进行回收后，按照转录组的建库流程构建常规的测序文库。

 图1 m6A甲基化富集建库流程示意图 Fu, Y et al (2014) Nature Reviews Genetics, 15(5): 293

5. 分别将构建好的2个测序文库，即m6A-seq library和RNA-seq library分别进行高通量测序。测序平台尽量保持一致，推荐illumina的Hiseq 2500以上平台，如illumina Hiseq 4000, X ten, Noveseq等。

6. 对下机数据进行生物信息学分析，对发生m6A甲基化程度较高的区域进行peak calling。由于不能做到单个碱基的分辨率，所以只能对大致的区域进行分析。从图2中我们可以发现，与右侧常规的转录组测序结果相比，在基因上有2处区域存在非常明显的高甲基化峰。

 图2 m6A甲基化peak calling region标准分析

7. 接下来我们会对mRNA上具体区域内甲基化程度进行高级分析，从图3中我们可以发现，在mRNA的5’起始位置，以及3’终止密码子区域存在高甲基化现象。

 图3 m6A 甲基化peak calling region 高级分析

以上就是关于m6A-seq的标准步骤，现在是不是对m6A-seq有一个非常直观的认识呢？！再次强调下，这种测序方法只能鉴定高甲基化的区域，并不能做到单碱基的分辨率。下面我们一起来看一看备注，到底这个实验会出现哪些“坑爹”的细节呢。

备注1：Total RNA的起始量前期建议在600-800ug以上。由于这个实验对于RNA纯度要求较高，建议老师在送样的时候多送一些，细胞数量最低建议在10⁸甚至是10⁹以上（大约8板）。肝脏和大脑等转录水平较为活跃的组织也是最优选择之一。mRNA在Total RNA中的比例约为2~4%，最后得到带有polyA的mRNA含量估计约在10ug到35ug之间。磁珠富集纯化这一步也会有一定的损失率，所以最后用于下一步实验所需的RNA理论上还会继续有所下降。血清等特殊样本目前仍然存在很大的技术难度。

备注2：这里对mRNA进行片段化之前有两种选择。既可以对mRNA进行回收后进行片段化，也可以直接对带有磁珠的polyA  mRNA进行片段化。片段化试剂盒和超声波仪都是可行的。理论上由于超声波仪采用共振的方式，最后回收的片段长度较为均一。而片段化试剂产生的片段大小不一，在第一步的基础上RNA继续有所损耗。

备注3：这个步骤是整个实验的难点所在，抗体免疫磁珠去抓取带有m6A的mRNA片段也是有一定效率和比例的，如果操作稍有不慎或者一些细节性的东西没有注意，片段化程度、抗体的抓取效率等细节都会直接影响到后期的实验结果。

下面我们再把前面的步骤合到一起，再来带大家回顾一下m6A-seq从建库到分析的步骤，详见图4。

 图4 完整的m6A-seq/MeRIP-seq建库实验加分析步骤流程图

讲完了m6A-seq，我们再来稍微讲一讲可以做到单碱基分辨率的miCLIP，具体流程如图5所示。简单地说，前面的步骤类似，接下来3’端会连上接头，5’端会进行P32标记。同位素标记的目的是在于，转膜后抗体-RNA复合物在切膜回收的时候能够更加精确获得自己想要的甲基化片段。如图6所示，虚线标记的位置就是我们要切膜回收的区域。当然，同位素实验过于危险，理论上这一步也可以不加同位素标记，但是准确率会有所降低。

图5 miCLIP建库流程

 图6 miCLIP切膜回收区域

接下来我们会对回收的片段进行反转录，当某个位点发生甲基化时，反转录会有一定的几率停止反应。最后对片段进行环化，图5中绿色的部分一旦“读取”完毕，第一个碱基就是我们要的甲基化位点。

今天的m6A甲基化检测专题到这里就结束了。很多老师和同学更关心的是如何将m6A甲基化和自己研究的课题结合起来，我们下一期专题中会进行重点讲解。那实验设计没思路怎么办？没关系，请大家期待下一期的m6A甲基化专题——m6A案例剖析与实验设计思路讲解。

参考文献：
1. Fu, Y., Dan, D., Rechavi, G., & He, C. "Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation." Nature Reviews Genetics 15.5 (2014):293-306.
2. Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T., & He, C. "Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation." Cell 169.7 (2017):1187.
3. Dan, Dominissini, et al. "Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq." Nature 485.7397 (2012):201-6.
4. Meyer, Kated., et al. "Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3′ UTRs and near Stop Codons." Cell 149.7 (2012):1635.
5. Linder, Bastian, et al. "Single-nucleotide resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome." Nature Methods 12.8 (2015):767.
6. Helm, M, & Y. Motorin. "Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate.” Nature Reviews Genetics 18.5 (2017):275.