去年6月，Life Technologies推出市场上第一台用声波精确控制细胞移动的流式细胞计数系统，这就是Attune® 声波聚焦流式细胞仪。这种聚焦技术在定量和观察细胞时能实现更佳的效率，同时又不牺牲分辨率和灵敏度。今年9月，Attune® 声波聚焦流式细胞仪蓝色/红色双激光配置新产品也上市销售了，它与已经销售的蓝色紫色双激光声波聚焦流式细胞仪具有相同的数据准确性和高灵敏度。

什么是声波聚焦流式细胞仪？

Attune® 声波聚焦流式细胞仪是第一款使用超声波（超过2 MHz，类似于那些在医学成像中使用的），而不是流体动力，将细胞置于沿着毛细管中轴的单个聚焦线上的流式细胞仪。声波聚焦在很大程度上与样品进样流速无关，使细胞能够紧紧聚焦在激光拷问点，而与样品流-鞘液流的比例无关。这允许细胞流速减慢，以便收集更多光子，以前所未有的体积样品通量实现高精确度分析。

Attune® 流式细胞仪实现了这一切，而无需高速或大体积鞘流，这些可能伤害细胞。此外，体积注射泵无需微珠，就能完成绝对的细胞计数，将费用和样品制备时间降至最低。相比之下，那些使用流体力学聚焦的细胞仪在所有流速下维持相同的样品速度，致使细胞失去焦点，因为样品核心变宽以增加流速。

传统的流体力学聚焦细胞仪有很多限制。因此，用户常常不得不：
• 为灵敏度而牺牲通量
• 为易用性而牺牲特征
• 为价格而牺牲性能
• 为占地空间而牺牲能力

声波聚焦技术让细胞处于有限的聚焦点，因此无需这些权衡。流式细胞仪的大部分标准应用已在Attune® 流式细胞仪上检验过，包括：
• 活细胞/死细胞鉴定
• 细胞周期分析
• 细胞增殖分析
• 基本的表型分析（最多6种颜色）
• 稀有细胞检测
• 凋亡
• 吞噬
• 磷酸化蛋白吞噬的检测
• 其他细胞内标志物

有了Attune® 声波聚焦流式细胞仪，您可以在分析珍贵样品或检测稀有细胞时获得高的样品进样流速和高精确度。您控制你的样品浓度、流速、您所检测的光子数量、您的实验长度，等等。有了可靠的结果，您能最有效地利用您的细胞。最棒的是，Attune® 声波聚焦流式细胞仪让一切变得简单。

所有样品通量流速下的精确度和灵敏度

Attune® 声波聚焦流式细胞仪在您最需要的时候实现了更高的灵敏度。即使是在高达1 mL/min的高流速下，您也能维持精确的校正。由于Attune® 流式细胞仪不受物理鞘液流的限制，故您可以控制细胞通过激光的时间。这意味着在分析微弱信号时，您可使用更低的流速来收集更多的光子，以便更好地了解您的结果以及更好地分离（图1和2）。

流体力学聚焦仪器

Attune® 流式细胞仪，正常的灵敏度模式

图1. 磷酸化特异抗体染色后更好的峰分离。细胞内目标的检测可能富有挑战性。用CD3和CD28的抗体刺激Jurkat T细胞，然后固定并透化，再用PE标记的磷酸化特异抗体染色。在Attune® 流式细胞仪和一台流体力学聚焦细胞仪上运行样品，并比较数据。曲线图显示了每个系统中刺激和未刺激样品所获数据的叠加。Attune® 声波聚焦流式细胞仪所获得的数据有着更高的精确度（峰更窄），这使得分离更佳，且数据更易阐释。

传统流式细胞仪             Attune® 流式细胞仪          Attune® 流式细胞仪
（最高灵敏度设置）        （标准灵敏度设置）          （高灵敏度设置）

图2. 细胞穿过时间控制下的灵敏度。在一台传统的高端流式细胞仪和Attune® 声波聚焦流式细胞仪上利用488 nm蓝色激光（上面一行）和405 nm紫色激光（下面一行）运行荧光微球（Spherotech Rainbow 3.2 μm）。传统的流式细胞仪是在最高灵敏度设置下运行，样品进样流速为15 μL/min（左列）。Attune® 流式细胞仪是在2种不同的设置下运行：标准灵敏度设置，100 μL/min的样品进样流速（中列），以及最高灵敏度设置，100 μL/min的样品进样流速，颗粒被激光照亮的时间增加了4倍（右列）。Attune® 流式细胞仪的标准设置实现了与传统流式细胞仪相同或更佳的灵敏度，而Attune® 仪器的高灵敏度实现了传统流式细胞仪无法检测的极弱微球的检测。

稀有细胞检测快了10倍

Attune® 声波聚焦流式细胞仪在比其他细胞仪快10倍的流速下实现了样品通量——高达1000 μL/min，让稀有细胞能以可靠的准确性快速检测，同时不舍弃任何数据（表1，图3）。Attune® 流式细胞仪每次运行可收集高达2,000万个细胞，且有着可调的收集速率（25-1,000 μL/min）.

表1. 流体力学聚焦细胞仪或Attune® 声波聚焦流式细胞仪的获取时间比较，利用来自再生障碍性贫血个体的血液样品，每个的停止门设在100万个粒细胞。

图3. 收集超过100万个肝细胞，并检测小鼠脾细胞中0.2%的稀有树突状细胞群。浆细胞样树突状细胞（pDC）是一种特化的细胞群体，它们在应答病毒时产生大量的I型干扰素，可根据其免疫表型CD19-、B220high、CD317+来鉴定。利用CD19 Pacific Blue™、CD317 Alexa Fluor® 488、CD45R/B220-PE直接结合物以及SYTOX® AADvanced™ 死细胞染料来进行小鼠脾细胞的四色染色。利用SYTOX® AADvanced™ 死细胞染料在活细胞上设门，然后在CD19-细胞上设门。根据CD45R/B220相对CD317的两参数图来鉴定pDC。利用500 μL/min的收集速率，获得130万个总细胞，细胞浓度为7.5×107个细胞/mL。浆细胞样树突状细胞被鉴定为B220+/CD317+（右上象限），占了CD19-活细胞的0.851%，仅占全部脾细胞的0.194%。

稀释您的样品，而不是数据质量

洗涤和裂解红细胞（RBC）可导致严重的细胞损失和损伤[1]。而Attune® 流式细胞仪明显更高的样品收集速率带来了一个无需洗涤、无需裂解的操作步骤，能最大程度地减少细胞损失，简化样品制备（图4）。此特征特别适用于那些浓度本身很低的样品。稀释的样品如脑脊液（CSF）、干细胞或任何细胞数量低的样品都可能花很长时间才能获得。

有了Attune® 流式细胞仪，即使是稀释的样品也能快速获得，而不折损数据。难收集的样品，如小鼠血液和骨髓、细针穿刺液或细胞少的样品，都能染色然后稀释，而无需洗涤或裂解RBC。高收集速率让获取成为可能——您能够在4分钟内运行最多4 mL。无样品制备过程中的样品损失，所有珍贵样品都能进行全盘检测。

图4. 省去样品制备，而不折损数据。用CD45 Pacific Blue™、CD3 Alexa Fluor® 488和CD4 PerCP-Cy®5.5 直接结合物标记正常全血（100 μL）。孵育15分钟后，用4 mL PBS稀释5 μL全血，未进行RBC裂解或洗涤，在Attune® 流式细胞仪上获取数据。荧光阈值设在Pacific Blue™染料上，只包含CD45阳性的细胞。在CD45相对SSC的图中（A）围绕淋巴细胞群体创建门，以分析相互排斥的CD4和CD8群体（B）。稀释样品，并使用500 μL/min的流速，所有制备步骤都被省去，而不折损数据。

利用Attune® 声波聚焦流式细胞仪开展细胞周期分析

细胞周期分析仅仅是一个例子，说明精确检测多个细胞群体之间的荧光强度差异很关键。有了Attune® 声波聚焦流式细胞仪，结果的变化极小，而与样品通量流速无关。您再也无需为了灵敏度而牺牲通量。
• 极小变化，即使样品流速很高
• 结果的变化更少（详见表1中%S阶段的变化）
• 无需为速度而牺牲灵敏度

我们在一种高端的流体力学聚焦细胞仪和Attune® 流式细胞仪上比较了其他五种细胞类型，包括每个例子的ModFit分析。分析中的样品通量流速为25uL/min（图5）。

图5. Attune® 声波聚焦流式细胞仪表现出更高的精确度。在与高端的流体力学聚焦细胞仪比较时，Attune® 流式细胞仪上收集的数据表现出较低的变异系数（%CV）和更多的不同细胞群体。

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本文由Life Technologies供稿，生物通编译。

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