Caitlin Smith撰写/张迪编译

生物通报道：Western Blotting依然是目前分离和检测蛋白最常用到的一种技术方法，但是要将这种技术变成你的有利手段，并不容易。因此优化实验操作手册至关重要，但是，正如Bio-Rad成像系统市场经理Ryan Short所说的，“大多数研究人员并不是Western blot技术专家——他们要解答的是更大的问题”，Ryan继续说道，“问题是大多数人都不知道何处需要优化。坦率地说，Western blot检测过程耗时太长。如果每个印迹实验都有花费你两天时间，那么还有多少时间确实能用于优化Western blot呢？”当然，类似抗体质量，封闭液和转印效率等因素也扮演了关键角色，让我们来仔细看看，现今还有哪些优化的技巧和工具。

加入合适数量的蛋白

虽然步骤优化至关重要，但是传统的Western Blot整个过程本身过长确实也带来了困难。Short相信一个成功的Western Blot实验操作指导中，最重要的因素之一就是确定每份凝胶中加入的蛋白量。

“这是非常重要的，因为大多数进行WB实验的研究人员都有一个兴趣蛋白，需要与内参（看家蛋白）比对”，Short说，“如果您的兴趣蛋白是一个低表达的蛋白，而你的内参蛋白是一种高表达的蛋白，那么在检测的动态范围内就必须有两种蛋白，以确保结果的可靠性。因此可能需要加大低表达蛋白的数量，大概有50-60ug蛋白，但在这个量上内参蛋白信号可能会远远超出了线性检测范围了。了解这些动力学对于Western blot获得好结果十分重要。”

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有效的封闭：脱脂牛奶以外

使用正确的封闭液将获得完全不同的一个结果。虽然牛奶是经常被使用到的封闭液，但现如今这种封闭液也许不如高质量商业化的封闭液。“封闭液应该结合到膜上不与相应抗体结合的区域”，Thermo Scientific公司Priya Rangaraj表示，“如果做不到这一点，你会看到斑点和增加的背景”。

目前Western市面上一些封闭液包括Thermo Scientific的StartingBlock Blocking Buffer，LI-COR Bioscience公司的Odyssey Blocking Buffer，以及来自Bio-Rad的PBS（含有1%酪蛋白封闭液）。（StartingBlock Blocking Buffer更多技术资料>> > ，）

“研究人员耗费大量的时间去去调整，检测各种一抗和封闭液”，“抗体的性能在与与正确的封闭液作用的时候，会得到显著改善”，LI-COR Bioscience公司的生化产品技术专家Shawn Mischnick说。

化学发光检测：选择一个长时稳定的信号

优化过程中另外重要的一点就是，检测信号的质量和稳定性，Advansta公司首席科学家Dmitry Bochariov说，“底物信号长时稳定，这有助于减少底物和培养基之间不一致性造成的相关变量，以及当印迹成像和曝光时产生的变量，”Bochariov说，“控制和复制这些变量是非常困难的，因为它们涉及人工处理的印迹，带有保护层，并且与记录工具，或者成像系统设备等其它人为因素有关。这些因素长期稳定的化学发光输出，可以大大弥补所有这些变量。”

比如说Thermo Scientific化学发光底物SuperSignal Substrates，就有针对三个不同靶标水平的试剂（皮克，中级豪微克，低级飞克）。

放大低表达蛋白信号的另一种工具就是Thermo Scientific的新产品：SuperSignal Western Blot Enhancer，这是一种增强剂，包含有两种试剂：抗原预处理液和一抗稀释液，能将信号强度和灵敏度提高3-10倍，从而显著降低背景，并增强低丰度和弱免疫反应性抗原的检测。

SuperSignal增强剂使用起来也很简单。在转印之后，封闭之前，用足量的抗原预处理液浸泡膜10分钟。一抗杂交前用一抗稀释液稀释一抗。其他操作均按照Western blotting的标准操作流程进行。此增强剂可用于PVDF膜或硝酸纤维素膜，并与荧光、比色法和化学发光检测兼容。（SuperSignal Western Blot Enhancer更多技术资料>> > ）

“增强剂不仅增加了信号，使得抗原表位更加容易接近一抗，而且也降低了背景，”Rangaraj说，“这对于低丰度，或弱免疫反应的抗原或蛋白，特别有用的”。而且，配合上Thermo Scientific的MYECL™成像仪（能进行WB结果数字图像，检测和获取）“基于CCD的成像系统具有相比于传统X光片，高出两倍的敏感性，以及十倍的动态范围，”Rangaraj说。        

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