Western印迹包含下列步骤：

• 在聚丙烯酰胺凝胶上分辨一个复杂的蛋白质样品。
• 将分辨好的蛋白质转移到膜上。
• 膜上特定蛋白质的鉴定。

对于一个成功的Western印迹，必须满足四个要求：

• 从凝胶上洗脱 – 在转移过程中蛋白质必须从凝胶上洗脱。如果它仍保留在凝胶上，则无法开展印迹分析。
• 吸附到膜上 – 在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上。如果蛋白质不吸附，则无法开展印迹分析。
• 处理过程中的蛋白截留 – 在转移后的印迹处理过程中，蛋白质必须仍然吸附在膜上。
• 处理过程中蛋白的可及性 – 吸附的蛋白质必须能与检测它的化学试剂接触。如果蛋白质被掩蔽，那它就无法被检测。

下面将讨论Western印迹中所涉及操作的理论和实际考虑。

在1-D或2-D凝胶上分离复杂的蛋白质混合物

在印迹之前分离复杂蛋白质混合物的最常用方法是一维（1-D）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），其中蛋白质是根据其分子量分离的（图4）。在某些情况下，使用非变性条件来分离天然蛋白。尽管这种方法通常不及变性电泳的分辨率，但是在一抗只识别非变性蛋白或必须在膜上保留蛋白质的生物活性时，这特别有用。

二维（2-D）凝胶电泳是分析细胞类型、组织和体液中蛋白质组成的理想技术，也是蛋白质组学的核心技术。2-D凝胶的免疫印迹提供了分子量和等电点的信息，在区分翻译后修饰所产生的蛋白质异构体上很有用（Celis和Gromov，2000）。在某些情况下，通过等电聚焦的一维分离后的免疫印迹可实现蛋白质分型（Poland等，2002；Eto等，1990）。二维印迹的例子如图5所示。

分子量标准品

凝胶中包含分子量（MW）标准品，或marker，有助于在电泳分离后估计感兴趣的蛋白质的大小。目前有两种类型的标准品，未染和预染。未染的MW marker通常包含已纯化的分子量已知的天然或重组蛋白。观察它们在凝胶或膜上的定位需要借助一个染色步骤。

预染的MW marker如图4所示。使用预染marker既有优点，也有缺点。预染marker可实现在电泳过程中监控凝胶上的蛋白质分离。它们也能指示后续转印步骤中的转移效率。然而，它们相对较贵，且染料的添加可能影响蛋白质迁移率。在确定分子量时，预染marker没那么准确，因为蛋白质上结合的染料会改变印迹过程中它们吸附到膜上的能力。

图4. Trail Mix™蛋白标准品（货号 70982）上带有三个预染marker和八个未染marker（它们都带有His Tag和S•Tag），实现了电泳过程中蛋白质迁移的直接观察以及任一Western印迹上准确的大小判定。

图5. 通过二维电泳分离的蛋白质的化学发光检测。大鼠成纤维细胞系的银染2-D凝胶（左）和同一张凝胶的印迹（右），在Immobilon®-P膜上用小鼠单克隆抗体杂交，并通过化学发光法观察。

聚丙烯酰胺的浓度

凝胶上聚丙烯酰胺的浓度可以是均匀的，也可以是梯度的。最常用的聚丙烯酰胺浓度，10%，最适合10-150 kDa范围内蛋白质的分离。如果正在分析未知的蛋白质，或需要更广泛的分离，建议使用梯度胶。例如，4-12%的Tris甘氨酸凝胶适合30至200 kDa范围内的蛋白质，而10-20%的凝胶能成功分离6至150 kDa的蛋白质。SDS-PAGE凝胶的厚度通常为1.0和1.5 mm；不过，对于印迹而言，较薄凝胶（= 1 mm）的蛋白质转移最好。

凝胶电泳缓冲液

最常用的凝胶电泳缓冲液是由Tris甘氨酸或Tris-tricine组成的。缓冲液中可能含有0.1%的去污剂，通常是SDS。Tris甘氨酸缓冲液系统适合分离分子量范围广（6-200 kDa）的蛋白质，并与变性或非变性条件兼容。Tris-tricine系统最适合分离较小的，需要在上样之前还原和变性的蛋白质（<10 kDa）。两种缓冲液系统都与蛋白转移到PVDF膜上兼容。Tris醋酸缓冲液有时用于较大蛋白的分离。

（实际内容以《蛋白质印迹手册》印刷版为准，如有错漏，敬请谅解）

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