了解下列章节中提出的有关免疫检测的概念，将有助于优化特定样品的操作。

• 双印迹

在Western印迹中避免非特异结合的一种新方法是由法国国家反兴奋剂实验室的Françoise Lasne博士开发的（Lasne，2001；Lasne，2003）。在研究重组人促红细胞生成素（EPO）时，Lasne博士发现重组和天然的EPO有着不同的等电点（pI）。重组EPO的pI为4.42-5.11，而天然EPO的pI偏酸性，为3.92-4.42。然而，在转印尿液样品时，二抗的超高非特异结合（NSB）让人难以区分重组和天然EPO。为了避免NSB，Lasne博士使用了“双印迹”。在一抗与印迹蛋白结合后，抗体在酸性条件下被转移到第二张Immobilon®-P膜。一抗从相应的抗原上释放，并通过中间体转移到第二张（双印迹）膜上。当双印迹膜与二抗杂交时，不存在其他的蛋白非特异结合，从而避免了背景问题。

“双印迹”也被用于转甲状腺素蛋白的检测，是检测低浓度的血清或尿液蛋白的有用方法。

• 检测底物

现代的免疫检测方法是基于酶连检测，利用与酶共价结合的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。结合在二抗上的酶催化特异底物的降解，产生信号。通常使用三种类型的底物：显色、化学发光和化学荧光，以及用荧光基团标记的二抗来检测。Immobilon® PVDF膜经过检测，可与所有市售的化学和化学发光底物兼容。

显色检测

显色检测（图14）利用结合的酶来催化反应，使得不溶性的有色沉淀物沉积，例如，不溶的蓝色化合物通过5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）和氮蓝四唑盐（NBT）的相互作用获得的（Leary等，1983）。这种技术很容易开展，不需要特殊的设备。不过，以下应牢记：

• 显色检测的灵敏度通常至少比化学发光试剂低一个数量级。
• 沉淀物的产生可能干扰酶活并限制灵敏度。
• 沉淀物难以从膜上剥离，限制印迹再次用于其他蛋白质的检测。

图14. 利用显色底物BCIP/NBT（KPL）对人血清中的转铁蛋白进行免疫检测。从左到右，5 μL人血清稀释物1:1,000、1:5,000、1:25,000、1:125,000。电转的蛋白与山羊抗人转铁蛋白（1:10,000稀释度）和AP结合的兔抗山羊IgG（1:30,000稀释度）杂交。

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