生物通报道：拷贝数变异（CNV）是指基因拷贝数出现的异常，主要表现为基因组大片段的缺失和重复。CNV是基因组结构变异的重要组成部分，与自闭症、认知功能缺陷、癌症等多种疾病有关。芯片是目前临床上检测CNV的主要工具，但芯片检测在有些方面也是力不从心。举例来说，芯片只能帮助我们判断是否存在序列重复（或缺失），要获得更加全面的信息只能求助于二代测序（NGS）。NGS可以达到更高的分辨率，还能同时检出倒置、易位等其他结构异常，甚至为人们提供SNP和indel的信息。

不过，为了检测CNV而测序整个基因组显然有些大材小用。不少研究者选择先富集自己感兴趣的序列再进行测序，比如只占基因组1%-3%的蛋白编码序列，或者与特定疾病有关的已知基因。这样的策略可以节省大量的人力、物力和成本，受到了广泛的欢迎。

CNV检测的老大哥

如果需要检测1Kb-3.5 Mb的染色体重复或缺失，研究者们一般选择使用芯片。芯片是一种经济实用的检测方法，非常准确而且覆盖度高，俄亥俄州立大学的助理教授Sameek Roychowdhury说。

不过芯片检测也有一定的局限，虽然芯片的分辨率高于G显带染色体分析（核型分析），但却检测不到染色体重排（比如倒置和易位），也无法鉴定插入或缺失位点。

而NGS（不论是全基因组测序还是靶向基因组测序（比如全外显子组测序）），“我们付出的越多，收获也就越大。不论是全基因组测序还是靶向基因组测序（比如全外显子组测序），都可以获得SNP、indel以及染色体结构重排的准确信息，”这都是芯片检测无法提供的，Roychowdhury说。

外显子组测序

坊间流传，随着测序成本的直线下降，靶向测序的吸引力会越来越小。对绝大多数应用而言，全基因组测序取代靶向测序只是时间问题。不过就目前来看，这一天离我们还有点儿远。我们在用NGS检测CNV的时候，仍然需要权衡不同方法的优劣，尽量减轻测序负担。

选择蛋白编码序列可以将人类基因组减少到35-70Mb，大约是整个人类基因组的2%。85%的已知致病突变发生在这个被称为外显子组的区域。制备测序用的外显子组文库也并不困难，市面上有许多商业化试剂盒可供选择。

这些试剂盒大多以杂交为基础，在特异性探针杂交之后进行PCR扩增。安捷伦的SureSelect、罗氏的NimbleGen’s SeqCap以及Illumina的Nextera都属于这类试剂盒，只是DNA片段化方法（超声法、酶处理等）或者探针指向的具体区域有所不同。这些试剂盒“对外显子组的定义是不同的，”瑞士心血管遗传学和基因诊断中心的Janine Meienberg博士说。她发现，没有哪个平台可以捕获所有已知的外显子，就算结合起来使用也做不到这一点。

还有一些试剂盒依赖于超多重PCR，将特异性的寡核苷酸作为PCR引物生成测序文库。这类试剂盒大多是用一套特别的引物获得PCR扩增版的外显子组，比如Thermo Fisher的Ion AmpliSeq™。有的试剂盒使用分子倒置探针或锁式探针（比如安捷伦的HaloPlex），这种探针能结合在目的片段的末端形成一个环，而其余的基因组片段被消化。   

杂交法和多重PCR法各有优劣：杂交捕获难以处理重复和高GC含量的基因组区域，而多重PCR法更适合5Mb以下的靶标区域。有个研究团队发现杂交法会遗漏7%-10%的蛋白编码序列，于是开始把这两种方法结合起来使用。

Roychowdhury及其同事指出，不同外显子组富集平台在击中率、均一性和SNP检出方面存在差异，不过“这些方法检测拷贝数变异都比芯片有效”。

任何涉及扩增的技术都有可能出现偏好，这也是NGS检测CNV的一个潜在缺陷。数字PCR中的分液技术可以将多重化反应分成一个个单独的反应，实现更加均一的扩增，减少NGS检测中的偏好，Bio-Rad公司的Svilen Tzonev介绍道。

只测序你想要的

除了试剂盒以外，市面上还有一系列基于杂交或PCR的靶向富集panel。这种产品旨在帮助人们检测一组特定的基因，比如与某种癌症有关的基因。用户们还可以使用厂家提供的设计软件，根据自己感兴趣的基因建立自定义panel。

最近，安捷伦发布了一体化的靶向序列捕获产品OneSeq。该产品结合了外显子富集所用的宽间隔探针与SNP芯片中密集的靶向性探针。OneSeq和安捷伦的免费软件SureCall相结合，可以整合拷贝数变异、SNP、indel以及杂合性缺失的数据分析。

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芯片、外显子组测序和靶向性panel都是CNV检测的实用技术，正可谓条条大路通罗马。但对于探索性研究而言，“我们更倾向于全基因组测序，以便发现新的事物，”华盛顿大学的助理教授Vincent Magrini说。

参考文献：

 [1] Martin, CL, Warburton, D, “Detection of chromosomal aberrations in clinical practice: From karyotype to genome sequence,” Annu Rev Genomics Hum Genet, 2015. [PubMed ID: 26077817]

[2] Meienberg, J, et al., “New insights into the performance of human whole-exome capture platforms,” Nucleic Acids Res, 43:e76, 2015. [PubMed ID: 25820422]

[3] Miya, F, et al., “A combination of targeted enrichment methodologies for whole-exome sequencing reveals novel pathogenic mutations,” Sci Rep, 5: 9331, 2015. [PubMed ID: 25786579]

[4] Samorodnitsky, E, et al., “Evaluation of Hybridization Capture Versus Amplicon-Based Methods for Whole-Exome Sequencing,” Hum Mutat, 2015. [PubMed ID: 26110913]

生物通编辑：叶予