光遗传学+CRISPR：利用光来控制基因组编辑[创新技巧]
【字体： 大 中 小 】 www.yiwulimax.com 时间：2016年4月6日 来源：生物通
摘要：
作为经常上头条的明星，光遗传学（optogenetics）和CRISPR这两个技术的碰撞会产生什么样的火花？2015年，科学家结合CRISPR和光遗传学技术，开发出各种光激活的CRISPR工具。这些工具让研究人员能够利用光从外部控制基因组编辑过程的地点、时机和可逆性。
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光活化的基因组修饰
之后，Sato实验室又推出了光活化系统来切割目标DNA序列，它产生的双链断裂（DSB）可通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）来修复。这个系统的独特之处在于它利用了一种“分裂的”核酸酶。作者将Cas9分成N端（2-713个残基，N713）和C端（714-1368个残基，C714）。作者将每个Cas9片段与一个二聚化的结构域相融合，创建了光活化的Cas9工具。
尽管作者尝试了几种不同的光活化设计，但他们最成功的设计是利用了磁性光控蛋白，来源于真菌感光体Vivid。这个新系统的昵称为paCas9-1，包含融合蛋白N713-pMag和nMagHigh1-C714，显示出低背景和高的诱导活性。与全长的Cas9相比，paCas9-1识别相同的PAM，并有着相似的定位特异性。在蓝光的激发下，paCas9-1能通过NHEJ诱导插入缺失（频率为20.5%），并通过HDR诱导修饰（频率为7.2%）。
作者还表明，他们能够通过修改paCas9-1来降低系统的背景活性。他们用nMagC714来取代nMagHigh1-C714，生成了paCas9-2。这种改变并未明显改变系统生成突变的效率，但降低了背景DSB。与他们之前的工作一样，Sato实验室还表明paCas9-2可以在空间上控制，并通过蓝光开关来可逆激活。
正如人们所期望的，Nihongaki等人证明，替换融合物中的Cas9结构域，也可以生成光活化的切口酶和抑制物（dCas9）。所有变异体的活性都是可逆且可重复的。
罩住CRISPR
此外，Alexander Deiters的实验室则采用了一种不同的方法来调控CRISPR。他们利用遗传编码的光罩（photocaging）技术，在Cas9蛋白上插入了一个可光去除的保护基团，也就是硝基苯罩住的赖氨酸（PCK）。为了在Cas9的特定位点插入PCK，研究小组使用了吡咯赖氨酰tRNA合成酶，在到达琥珀终止密码子时加入PCK。
研究人员首先检验了罩住Cas9的哪个赖氨酸能够让蛋白的切割能力更好地失活，发现是K866赖氨酸。然后，他们利用双报告基因荧光检测，证明Cas9 K866PCK突变体的确失活，而用紫外光（365nm）照射后，它显示出与野生型Cas9同样的切割活性。最后，研究人员证明，这种光罩Cas9系统能够让内源的基因表达沉默。
如今，无论你想激活、抑制或修改基因，你身边都有工具，通过光来控制基因组编辑。随着CRISPR和光遗传学的发展，我们期待未来看到更多更酷的应用。（生物通 薄荷）
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