去年，一个名为乔赛亚•扎耶那（Josiah Zayner）的生物黑客在自家的厨房直播对自己基因改造的过程，他将自家公司生产的 CRISPR/Cas9产品直接注入手臂，想要让自己的手臂肌肉更强壮。虽然这个让人啼笑皆非的直男梦想没有实现，但是CRISPR/Cas9系统作为一种简单易行、适用于多种生物的基因编辑方式，未来在实验室中一定会成为和PCR一样的常规操作，让实验小白也能轻松实现对目标基因的改造。

图1. IDT CRISPR/Cas9 基因编辑系统

CRISPR/Cas9基因编辑系统主要由两部分组成：相当于“扳手”作用的Cas9蛋白与相当于“螺纹钉”作用的CRISPR向导RNA（guide RNA，gRNA）。“螺纹钉”负责对靶位点进行定位，并招募和激活Cas9蛋白；Cas9蛋白则负责切割DNA（图2）。

图2. "分子改造器" CRISPR/Cas9

实现该“分子改造器”的方法有质粒转染、体外转录RNA、病毒包装等方法。我们今天为大家介绍一种最短只需要1小时即可启动基因改造的IDT（Integrated DNA Technologies）公司Alt-R® CRISPR基因编辑系统。该系统主要采取的转化核糖蛋白复合物（Ribonucleoprotein complex，RNP）的方法，RNP即Cas9蛋白和gRNA结合形成的具有编辑功能的复合物。

3步组装“分子改造器”

Alt-R® CRISPR系统的实验操作只需3步，就像把大象放进冰箱一样简单（图3）！

图3. IDT Alt-R® CRISPR/Cas9实验流程

表1所示，IDT同时也提供针对不同模式生物的Protocol，相信总有一款适合你！

表1. IDT Alt-R® CRISPR 相关实验流程

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优化的“螺纹钉”

在IDT Alt-R® CRISPR系统中，组成“螺纹钉”gRNA的“零件”crRNA和tracrRNA均经过了特殊优化（图4）。天然tracrRNA较长，含89个碱基，合成复杂且费用较高。优化后的67个碱基的通用型tracrRNA，可与特异的crRNA在体外结合形成gRNA。36个碱基的crRNA包括结合靶序列的结构域（含20个碱基）和结合tracrRNA的结合域（含16个碱基）。

图4. IDT Alt-R® CRISPR/Cas9 系统组成

IDT通过实验证明36碱基的crRNA和67碱基的tracrRNA组合效率最高，且二者均添加了特殊化学修饰，可使gRNA具有核酸酶抗性。为便于追踪和筛选被成功转化的细胞，可在tracrRNA中添加荧光基团修饰。

你只需要提供符合要求的20个碱基靶序列即可下单crRNA，搭配IDT公司的通用tracrRNA和Cas9蛋白，只需要稍加组装，即可成为直入基因组靶区腹地的神器。

不过值得一提的是，与其他CRISPR/Cas9方式相比，RNP的细胞毒性低、不易引起免疫反应，且在体外即可对DNA片段进行切割，便于在预实验中初步验证“分子改造器”的效率（图5）。

图5. 利用Alt-R CRISPR-Cas9系统阳性对照crRNA组成的RNP在体外对柱纯化Hs HPRT扩增产物进行编辑
体外基因编辑的体系为10 μL，Sample1为对照组，只含Hs HPRT基因编辑模板不含RNP；Sample 2包含模板和RNP。随后利用片段分析仪进行编辑效率分析。

如图6所示，IDT在线工具提供针对人、大鼠、小鼠、斑马鱼、线虫等多种模式生物的预设计crRNA序列库。用户只需选择物种和输入基因名即可获取预设计位点。

图6. IDT crRNA在线设计工具
（https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN）

如果预设计库中没有针对靶目标的“螺纹钉”，你可以输入Fasta序列进行定制设计并利用在线“crRNA检查器”（CRISPR-Cas9 crRNA Checker）排查潜在的脱靶位点。IDT在线工具凝结了很多科学家实践多年的心血，在设计层面充分把控了脱靶风险。

降低脱靶率的“扳手”

人类干细胞上的测试结果表明，与其他高保真Cas9酶比，IDT的Alt-R® S.P. HIFI Cas9呈现出稳定的中靶编辑活性，脱靶率又极低。我们被这个高保真的Cas9酶的表现所折服，已在使用它来开发基于基因编辑的疾病治疗方案。

——马修•波特斯（Matthew Porteus） 博士
干细胞移植专家，美国斯坦福大学

波特斯博士所提的在人类干细胞测试中胜出的高保真Cas9酶，为IDT科学家通过对250000个Cas9突变体筛选后，优化出的Alt-R®️ S.P. HIFI Cas9酶。众所周知，CRISPR 基因编辑的脱靶效应是其作为医疗用途的潜在隐患。而Alt-R® S.P. HIFI Cas9 蛋白则特别适合脱靶效应敏感的应用环境。该酶使CRISPR系统成为更精确的基因组编辑工具。

如图7所示，Alt- R® HIFI Cas9蛋白与Kleinstiver等人发表的SpCas9-HF1 （Kleinstiver et al., Nature 529:490-495）以及Slaymaker等人发表的eSpCas9（Slaymaker et al., Science 351:84-88）在脱靶率上的表现高度一致：即相比普通的野生型Alt-R® S.P. Cas9蛋白，对EMX1，HEKSite4或VEGFA3基因编辑的脱靶效应显著降低；同时，Alt-R® HIFI Cas9 蛋白的有效切割效率与野生型接近。

图7. Alt-R® S.P. HIFI Cas9 可保证靶向编辑效率的同时又无脱靶现象。

Alt- R 普通野生型 Cas9 （深蓝色）、Alt-R HIFI Cas9 （橙色）、SpCas9-HF1 （浅蓝色）、eSpCas9（灰色）4 种蛋白分别与靶向 EMX1，HEKSite4 或 VEGFA3 基因的 Alt-R gRNA 结合形成 1 μM RNP复合物。利用 Lipofectamine RNAi MAX 转染试剂将 10 nM 的 RNP 分别转染到 HEK-293 细胞系。48 小时后提取基因组 DNA 进行切割率分析。

目前，IDT Alt-R® CRISPR 系统及 Alt-R® S.P. HIFI Cas9 酶的优越性已得到许多实验室的认可，广泛应用于各种细胞，小鼠，斑马鱼，植物等系统中。另外，IDT还提供Alt-R® CRISPR-Cas12a (Cpf1)系统 ，为不能被CRISPR-Cas9体系编辑的区域提供新的CRISPR目标位点。该系统中，Alt-R® A.s. Cas12a (Cpf1)酶可识别 PAM序列TTTV。该系统使在生物体内编辑富含AT碱基区域的基因组成为可能。

图8. IDT Alt-R® CRISPR-Cas12a 系统组成

图9. IDT Alt-R® CRISPR系统被多篇发表在高质量期刊的文献所引用

部分使用IDT Alt-R® CRISPR发表的文章

Riddle MR, Aspiras AC, et al. (2018) Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature, 555 : 647–651.

Luo L, Bokil N, et al.. (2017) SCIMP is a transmembrane non-TIR TLR adaptor that promotes proinflammatory cytokine production from macrophages . Nat Commun, 8 : 14133.

Agudelo D, Duringer A, et al.. (2017) Marker-free coselection for CRISPR-driven genome editing in human cells. Nature Methods, 14 :615–620.

Mikheikin A, Olsen A, et al. (2017) DNA nanomapping using CRISPR-Cas9 as a programmable nanoparticle. Nat Commun, 8 : 1665.

Kohler S, Wojcik M, et al.. (2017) Superresolution microscopy reveals the three-dimensional organization of meiotic chromosome axes in intact Caenorhabditis elegans tissue . Proc Natl Acad Sci USA, 114 : E4734–E4743.

Seki A, Rutz S. (2018) Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. doi: 10.1084/jem.20171626

Quadros RM, Miura H, et al. (2017) Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins . Genome Biology, 18 : 92.

Han X, Liu Z, et al. (2017) Cas9 ribonucleoprotein delivery via microfluidic cell-deformation chip for human T-Cell genome editing and immunotherapy . Adv Biosys, 1 : 1600007.

Andersson M, Turesson H, et al. (2018) Genome editing in potato via CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein delivery. Physiol Plant. doi: 10.1111/ppl.12731

Brinkman EK, Kousholt AN, et al. (2018) Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Res. doi: 10.1093/nar/gky164

Kim KW, Tang NH, et al. (2018) A neuronal piRNA pathway inhibits axon regeneration in C. elegans. Neuron, 97 : 1–9.

Al Abdallah Q, Ge W, Fortwendel JR. (2017) A simple and universal system for gene manipulation in Aspergillus fumigatus: in vitro-assembled Cas9 guide RNA ribonucleoproteins coupled with microhomology repair templates. mSphere, 2 : e00446–17.

di Pietro F, Valon L, et al.. (2017) An RNAi screen in a novel model of oriented divisions identifies the actin-capping protein Z β as an essential regulator of spindle orientation. Curr Biol, 27 : 2452–2464.

更多使用Alt-R CRISPR基因编辑系统发表文献

https://www.idtdna.com/pages/education/citations?categories=alt-r-crispr-cas9

除了以上的“扳手”和“螺纹钉”，针对整个编辑流程IDT还提供下列试剂为你的基因编辑保驾护航。Alt-R® Genome Editing Detection Kit，可用于快速检测CRISPR的编辑效率；Alt-R® CRISPR-Cas9 Electroporation Enhancer可用于提高难转化细胞系的电转效率。

工欲善其事必先利其器。上海纳昂达作为美国IDT公司在中国大陆地区的独家授权代理商，提供以上全套神器。如你有任何IDT Alt-R® CRISPR相关技术问题，请联系我们sales@nanodigmbio.com。