蛋白质消化

这种方法介绍了固定在Immobilon® PVDF转印膜上蛋白的制备，以便质谱分析。
提示：质谱兼容的膜染料包括考马斯亮蓝、氨基黑或Sypro印迹染料。

必需的设备和溶液
• 50%甲醇，溶于Milli-Q® 水中。
• 30%乙腈，50 mM碳酸氢铵
• 胰蛋白酶，溶解于Milli-Q® 水中，浓度为0.1 mg/mL。
• 80%乙腈，溶于Milli-Q® 水中。
• 真空过滤器。
• 微量过滤管。
• MALDI-TOF基质。

步骤
1. 将蛋白质从凝胶转移到膜上（蛋白质转印操作，第35-38页）。
2. 用考马斯亮蓝或氨基黑对转印膜进行染色（操作2.3 通过不可逆染料观察，第47页）。
3. 用水清洗染色的膜，并干燥。
4. 用干净的手术刀切下包含目的蛋白的膜，放入单独的微量离心管中。
5. 用500 μL 50%甲醇对膜进行脱色，室温下脱色2小时。
6. 弃上清，让膜干燥。
7. 加入10 μL 30%乙腈，50 mM碳酸氢铵和4 μL 0.1 mg/mL胰蛋白酶。
8. 室温下过夜孵育。
9. 将上清转移至干净的微量离心管。
10. 用20 μL 80%乙腈超声处理15分钟，提取肽段。
11. 将提取物与之前的上清液合并。
12. 在真空离心管中干燥消化物。
注意：或者，使用默克密理博的ZipTip®SCX移液器吸头来纯化和浓缩肽段消化物，以取代干燥。若要使用此方法，用0.5% TFA（确保pH <3）酸化消化物，并按照ZipTip®SCX移液器吸头的操作指南进行（默克密理博刊物编号 P36444）。
13. 以少量30%乙腈、0.1% TFA重悬每个肽段提取物。
14. 将1-2 μL 消化物上样到MALDI板上，并与1 μL基质混合。

印迹保存

PVDF是一种耐化学性的聚合物，有着出色的长期稳定性。对于那些需要保存以供日后使用的印迹而言，保存条件是由与膜结合的蛋白质的稳定性决定的。我们建议低温保存，室温对一些蛋白质来说也足够。

必需的材料
• 干燥的Immobilon® PVDF转印膜。
• 两张Whatman® 3MM滤纸。
• 两张卡纸或薄的硬纸板。
• 回形针。
• 塑料袋。

步骤
1. 将干燥的印迹放在两张干净的Whatman® 3MM滤纸中间。
2. 将印迹-滤纸三明治放在两张卡纸之间。
3. 用回形针夹住边缘。回形针不应与印迹重叠。
4. 将它们放入可密封的塑料袋中。
5. 关闭或密封塑料袋。
6. 将印迹保存在所需的温度：
4°C 最多2周
20°C 最多2个月
70°C 长期保存

注意：保存在冰箱中的印迹不能受到机械振动，这会导致膜破损。印迹应恢复到室温后，才从塑料袋中取出。印迹也可放在塑料袋中，置于4°C，但应加入叠氮化钠等杀菌剂，以防止细菌生长。在使用之前，必须彻底洗掉叠氮化物，因为它会抑制HRP的活性。

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