症状

可能的原因

补救办法

条带弥散/扭曲

膜未在甲醇中均匀润湿

整张膜必须用甲醇预润湿；整张膜应均匀地从不透明变为半透明。

膜下以及堆积层的其他各层之间存在气泡

在组装堆积层时，利用移液管或搅拌棒，轻柔滚动以去除任何截留的气泡。

凝胶和膜之间的接触不均匀

确保整张凝胶和膜的表面有良好接触。

在转印过程中产生太多热

运行的温度不应超过20°C。对于槽转印，预冷缓冲液，或在冷室中开展转印。对于半干转印，要么缩短运行时间，增加滤纸数量，要么降低电流。

在半干转印过程中滤纸变干

在转印之前确保滤纸彻底湿透，或使用更多滤纸。确保堆积层在15分钟内组装好。

蛋白质转印太快；蛋白质累积在膜表面

降低电场强度。

信号弱

蛋白质穿过膜

将电压降低最多50%，增加蛋白质必须与膜接触的时间。

高负电荷的蛋白质（由于天冬氨酸和谷氨酸含量高）往往在电场中非常快速地移动。降低电压，以减慢这些蛋白质的迁移。

凝胶中SDS的存在可能抑制蛋白质的结合。在转印缓冲液中平衡凝胶至少15分钟。

转印缓冲液中甲醇浓度太低，不利于SDS的去除。将甲醇增加至15-20%，特别是对于较小分子量的蛋白质。

膜必须用甲醇预润湿；整张膜应均匀地从不透明变为半透明。

蛋白质保留在凝胶中

如果转印缓冲液中的甲醇浓度过高，它会去除蛋白质中的SDS，导致蛋白沉淀在凝胶中。这会降低高分子量蛋白质的转移。如果蛋白沉淀是个问题，那么可在转印缓冲液中添加SDS（0.01%-0.05%），以提高溶解度。此外，过量甲醇往往收缩或收紧凝胶，从而抑制大分子量蛋白质的转移。

蛋白质的等电点处于或接近转印缓冲液的pH值

等电点与转印缓冲液的pH值相同的蛋白质将无净电荷，因而不会在电场中迁移。为了促进转移，尝试更高pH值的缓冲液，如10 mM CAPS缓冲液（pH 11），包括10%甲醇，或较低pH值的缓冲液，如乙酸缓冲液。

当凝胶和/或转印缓冲液中使用尿素时，检测不佳

通过循环的缓冲液设置，或在冷室中运行转印，来降低温度。尿素受热会引起蛋白质的氨基甲酰化，从而改变蛋白质中氨基酸的电荷。这会影响抗体识别和结合所必需的表位。

蛋白质转移不彻底

对凝胶染色，以检查残留蛋白质。如果转移不彻底，请检查您的转印技术。

蛋白质保留不佳

一旦转印完成，确保膜彻底干燥，以实现蛋白质的最佳结合和固定。这应在下游检测之前完成。

无信号

蛋白质未转移

检查转移过程中凝胶和膜的方向。使用预染的分子量标准品来监控转移。

小分子量蛋白质的转移不佳

蛋白质保留不够，SDS干扰小分子量蛋白质的结合

换用Immobilon^®-P^SQ转印膜。去除转印缓冲液中的SDS。

转印缓冲液中的甲醇浓度低

在转印缓冲液中使用较高比例的甲醇（15%-20%）。

蛋白质结合的时间不够

较低电压可优化小蛋白与膜的结合。

电流不能穿过膜。

将膜和滤纸切成与凝胶相同的大小；切勿超出。

大分子量蛋白质（~ >80 kDa）的转印不佳

甲醇浓度过高

甲醇浓度降低至10%（v/v）或以下能让凝胶溶胀，从而协助大分子量蛋白的转移。而且，较低比例的甲醇也会减少蛋白的SDS损失，减少凝胶中的蛋白沉淀。对于SDS对膜结合的干扰，>200 kDa的蛋白质不如<100 kDa的蛋白质灵敏。

正电荷蛋白质的转移不佳

蛋白质在转移缓冲液中带正电荷；蛋白质向阴极移动。

反转转印堆积层，让Immobilon^® 转印膜在凝胶的阴极一侧。

半干转印不佳

电流绕过凝胶堆积层

确保膜和滤纸切成与凝胶相同的大小，切勿超出。

各种大小的蛋白质转移不佳

转移大蛋白和小蛋白需要不同的条件

请参考“宽分子量范围蛋白质的转移可能需要多步的转移”（T. Otter et al., Anal. Biochem. 162:370-377 (1987)）

在半干转印中使用三缓冲液系统。