在了解了这些小伙伴是谁之后，我们自然要问，它们在干什么？

它们在干什么？

通过16S扩增子测序，我们大致了解了它们是谁，但我们并不知道它们在干什么。即使是单一物种，微生物也不尽相同。它们往往有着不同的基因，行使着不同的代谢功能。正因为如此，我们需要鸟枪法宏基因组学，来揭示整个群落的生物学功能。

鸟枪法测序，指的是对从微生物群落中提取出的DNA片段进行测序。这种方法代表了完整的细菌基因组，因此几乎不受镶嵌性和偏向的影响。它还包含了更多信息，可对近亲和远亲做出准确的系统发育推断。然而，最实质性的优势是它提供了细菌群落中存在的基因信息。

早前，一个国际研究团队对36个沙眼衣原体分离株的基因组进行了测序，并开展系统发育分析。结果表明，过去利用ompA来预测系统发育结构从而对衣原体进行分类是误导性的，因为这一区域的广泛重组掩盖了真正的关系。（延伸阅读：Nature Genetics：衣原体原本的分类不可靠）

对于病毒微生物组的研究，全基因组测序也是个不错的选择，因为病毒中没有相应的16S。人们往往使用Illumina测序，有时还结合Pacific Biosciences的长读取测序，深入了解病毒微生物组，看看它们包含哪些基因。

测序流程也与平常的DNA测序相似，包括DNA提取、文库制备、测序及数据分析，不过在样品处理时需要特别留心，因为制备和储存过程可能会影响结果。在一些微生物组样品中，宿主DNA占了绝大部分，甚至高达99%，这为微生物样品的分析带来了难题。微生物的测序读取仅仅占了极小的一部分。若想获得足够高的序列覆盖度，要么是费用上不允许，要么是技术上不可行。

NEB的NEBNext® Microbiome DNA Enrichment Kit则解决了这一难题。它能够有效去除高达98%的甲基化宿主DNA（包括人类DNA），而保留无CpG甲基化或极少CpG甲基化的微生物DNA，从而将微生物组DNA的测序费用降低至更合理的水平。

Zymo也推出了室温的核酸稳定剂DNA/RNA Shield。它能够确保样品储存或运输过程中的核酸稳定性。DNA/RNA Shield裂解细胞并让核酸酶和病毒失活，否则样品的组成很可能会发生变化。

当然，真正的困难在于数据分析这一部分。有时，你会发现两个相近的大肠杆菌菌株有着截然不同的功能内容，而不同的分类群却有着相同的功能内容。究其原因，大抵是参考基因组缺乏，而那些现有的参考基因组又缺乏足够的注释。

人类微生物组计划（HMP）的目标之一就是获得3000种微生物分离株的参考基因组序列。这一计划由美国NIH资助，通过16S和WGS宏基因组学研究来认识多个人体部位微生物群落的复杂性，包括鼻腔、口腔、皮肤、胃肠道和泌尿生殖道，并了解人类微生物组的改变如何与健康或疾病相关联。

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